卢丽华，吴金斌，余振东，赵春娟，2，翟庆娜，2，周 亮

（1.北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳 518036；2.汕头大学 医学院；3.北京大学深圳医院 男性生殖与遗传重点实验室）

miR-452在肾透明细胞癌中的异常表达研究

卢丽华1，吴金斌1，余振东1，赵春娟1，2，翟庆娜1，2，周 亮3＊

（1.北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳 518036；2.汕头大学 医学院；3.北京大学深圳医院 男性生殖与遗传重点实验室）

目的 检测miR-452在肾透明细胞癌组织中的表达差异，探讨miR-452在肾癌发生过程中的作用。方法提取20例肾透明细胞癌及其相应癌旁组织的总RNAs，通过逆转录（RT）方法获得cDNA后，采用实时定量PCR（RT-qPCR）技术检测组织中miR-452的表达差异，并分析其与肾癌患者临床病理特征的关系。结果与相应的癌旁组织相比，miR-452在肾透明细胞癌组织中显著高表达，癌组织较癌旁组织升高约4.69倍，但其异常表达与肾癌患者临床病理特征并无显著相关性。结论miR-452在肾透明细胞癌组织中明显高表达，其可能作为重要的致癌基因参与了肾癌的发生与发展过程，可能成为潜在的肾癌标志物，为肾癌的早期诊断及治疗提供新靶点。

miR-452；肾透明细胞癌；病理特征

（ChinJLabDiagn，2012，16：0237）

microRNAs（miRNAs）是一组不编码蛋白质的短序列RNA，通过与靶基因mRNA3’UTR互补结合来调控基因表达。已有研究表明，约50%miRNA定位于基因组上与肿瘤相关的脆性位点［1］。大量的研究证实，异常表达的miRNA在肿瘤的发生发展过程中起到非常关键的作用。Zhou等通过第二代基因测序技术对10例肾透明细胞癌组织进行miRNA的表达谱检测，发现miR-452在肾透明细胞癌组织中表达差异显著，癌组织较癌旁组织表达明显上调［2］。但是目前没有进一步的实验验证这一测序结果，其他关于miR-452的研究报道也寥寥无几。本实验主要采用RT-qPCR技术检测肾透明细胞癌及其相应癌旁组织中miR-452的表达水平，分析其异常表达与肾癌患者临床病理特征的相关性，探讨miR-452在肾癌发展过程中的作用，可能为临床上肾癌的诊断及治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源20例肾透明细胞癌及其相应癌旁组织标本主要来自广东各大医院行手术治疗的肾癌患者。患者术前均未作化疗、放射治疗或免疫治疗等抗肿瘤疗法。所有患者均签署知情同意书，并获得所在医院伦理委员会批准。应用国际抗癌组织（UTCC）／美国癌症联合会（AJCC）临床分期标准对肾癌患者进行临床病理分期。所得标本保存于RNAlater中并置于液氮或－80℃低温冰箱。

1.2 主要试剂及仪器miRNA逆转录试剂盒（miScript Reverse Transcription Kit）及荧光定量PCR试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均购自Qiagen公司（德国），特异性miR-452引物由Invitrogen公司（美国）合成，上游序列为：5’-AACTGTTTGCAGAGGAAACTGA-3’；其下游引物为miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒提供的通用引物（详见试剂盒说明书）。内参基因U6由上海生工生物技术公司（中国）合成，上游序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下 游 序 列 为：5’-ACGCTTCACCGAATTTGVGT-3’。实验中用到的主 要 仪器：普 通 PCR 仪 （Bio-RAD）、qPCR 仪（ABI7000）、电泳仪（Bio-RAD）、台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、离心机（eppendorf）、－80℃超低温冰箱及普通冰箱。

1.3 组织总RNA提取应用Trizol试剂在液氮中研磨肾癌及癌旁组织提取总RNA。主要抽提步骤如下：1）取－80℃冻存肾癌及其相应的癌旁组织各50mg，在液氮中研磨；2）加入1ml Trizol试剂（Invitrogen，美国），继续研磨成粉末状提取RNA；3）用氯仿、100%异丙醇、75%乙醇分离并洗涤RNA沉淀；4）用30μl无RNase H2O溶解RNA，－70℃保存备用。

1.4 RT-qPCR琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度仪测定RNA浓度及质量后，用miScript Reverse Transcription Kit试剂盒（Qiagen，德国）进行miRNA逆转录。按照试剂盒说明书依次加入模板RNA和反应试剂，1μg RNA＋4μl Buffer RT＋1 μl Mix＋适量H2O。反应体系为20μl。反应条件为37℃、1h，95℃、5min。qPCR 应用 miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒（Qiagen，德国），反应按照试剂盒说明书进行：1）1μl cDNA＋0.4μl miR-452引物＋10μl Mix＋2μl UP＋6.6μl H2O；2）1μl cDNA＋0.4μl U6F＋0.4μl U6R＋10μl Mix＋8.2μl H2O。反应体系均为20μl。反应条件为：95℃、15min，94℃、30s，55℃、15s，70℃、30s，设置2个重复孔，40个循环结束。

1.5 RT-qPCR结果判定本实验设实验组和对照组两组。肾癌组织miRNA表达量作为实验组（c）；相应癌旁组织miRNA表达量为对照组（n）。miR-452作为两组的目的基因，U6作为内参进行标准化处理。CT值表示反应荧光强度到达阈值时所经过的扩增循环次数。△CTc＝CTc目－CTc内，△CTn＝CTn目－CTn内。目的基因的相对表达量（Re）采用△△CT的方法进行分析，△△CT＝△CTc－△CTn，RE＝2－△△CT［3］。

1.6 琼脂糖凝胶电泳及结果判定将qPCR扩增产物各取5μl，与Loading Buffer混合均匀后点样至约2%琼脂糖凝胶孔隙中。设电泳电压110V，时间30min。电泳结果若均显示单条亮带，说明qPCR扩增产物cDNA具有特异性。若癌标本较对照标本条带亮，说明目的基因上调；反之较暗则为下调。

1.7 统计学分析应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析。对肾癌及其相应癌旁组织的实验数据做配对样本的双侧t检验分析，对异常表达的miR-452与肾癌患者临床病理特征的相关性分析进行卡方检验。认为P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA抽提与质控RNA提取完成后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外照胶仪下显像示28 s、18s、5s三条清晰条带；紫外光分光光度仪检测RNA浓度均大于400ng／μl，OD值于1.8－2.1之间。说明提取的RNA浓度及质量良好。

2.2 RT-qPCR结果通过 RT-qPCR 技术检测上述肾癌组织标本中miR-452的表达差异。应用公式2－△△CT计算肾癌中 miR-452的相对表达量，对Re＝2－△△CT取对数［log2（Re）］后可得出－△△CT值，表示癌组织与癌旁组织中miR-452的相对表达差异，图1（数据符合正态分布）。由△CT＝CT目－CT内可分别得到癌与对照组的△CT值，数据符合正态分布。运用SPSS13.0进行统计分析，结果发现，miR-452在肾癌组织中显著高表达，平均上调倍数为4.69。其中，20例配对标本中，miR-452上调率为85%（17例）。上述统计结果均有统计学意义（P＝0.00＜0.05）。

2.3 琼脂糖凝胶电泳结果电泳结果显示，癌组织标本的条带明显比癌旁组织标本亮，说明miR-452在肾癌组织中显著上调。电泳结果与RT-qPCR数据分析结果一致，说明RT-qPCR结果可靠（图2）。

2.4 异常表达的miR-452与肾癌患者病理特征的关系将肾癌患者的临床资料根据病理特征（性别、年龄、TNM分期）进行分组。按性别分为男性组和女性组；按中位年龄47岁分为＜47岁组和≥47岁组；按TNM分期分为T1N0M0和T2N0M0组；以miR-452在肾癌组织中相对表达差异－△△CT的平均值2.04为界，将20例病例标本分为miR-452高表达组和低表达组。

运用SPSS13.0进行卡方检验分析miR-452表达与肾癌患者各临床病理特征之间的关系。结果表明肾癌组织中异常表达的miR-452与患者的临床病理特征并无明显相关性。

图1 20例肾透明细胞癌组织中miR-452的相对表达差异（－△△CT值）

图2 肾透明细胞癌与癌旁组织中miR-452RT-qPCR产物电泳图

3 讨论

泌尿系统肿瘤中，肾癌是仅次于膀胱癌发生的第二大恶性肿瘤，早期不易发现，治愈率及预后生存率均较低，而且发病率以每年约2.5%的速度增长［4］。目前针对肾癌，主要的治疗方法有放射疗法、化学治疗及免疫疗法，但是这些疗法都会引起严重的副作用。因此，找到新颖的诊断及治疗肾癌的靶点，已经成为临床研究人员追寻的确切目标。

第二代基因测序的发展为肿瘤miRNA表达谱的检测提供了技术平台。Weng等通过微阵列、RTPCR及第二代基因测序等技术方法对冰冻和福尔马林固定的肾癌组织进行了miRNA表达谱的检测［5］。Zhou等应用第二代大规模平行测序技术进一步证实了肾透明细胞癌组织miRNA的表达谱，发现，与相应的癌旁组织相比，miR-452在肾透明细胞癌癌组织中表达明显上调［2］。本次实验主要应用RT-qPCR技术着重对miR-452在20例肾透明细胞癌及其相应癌旁组织中的表达进行验证。将得到的实验数据进行统计学处理后，结果显示，miR-452在癌组织中存在过表达情况，尽管统计结果表明肾癌组织中miR-452的异常表达与患者的临床病理特征并无显著相关性，但是可以肯定的是异常高表达的miR-452与肾癌的发生和发展密切相关，极有可能作为一种重要的致癌基因参与了肾癌的发生与发展过程。并且，与相应的癌旁组织相比，miR-452在癌组织中显著高表达，平均相差5倍左右，因而miR-452可能成为潜在的肾癌特异性标志物，提高肾癌的早期诊断率。

Neil等通过研究表明在神经嵴细胞中有大量的miR-452，充足的miR-452的存在可以纠正Dlx2的适当表达。另外，miR-452还可以调节咽弓上皮－间叶细胞之间的信号传导，包括 Wnt5a、Shh和FGf8在Dlx2的表达［6］。SOX2是一种维持胚胎和成人干细胞多能性的关键基因，Fang等应用第二代测序技术发现敲除SOX2基因可引起一系列的microRNA的表达发生改变，SOX2可调控miR-452的表达下降［7］。本实验应用RT-qPCR技术检测到miR-452在肾透明细胞癌组织中显著上调，可推测miR-452在肾癌的发生发展过程中可能起到了致癌基因的作用。但是，目前关于miR-452在肾癌发生发展过程中的作用机制尚未明确，相关的文献较少，仍处于探索阶段，尚待深入研究。本文通过对miR-452在肾透明细胞癌中的异常表达研究，以期为临床上肾癌的诊断及治疗提供一定的实验依据。

［1］Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：2999.

［2］Liang Zhou，Jiahao Chen，Zhizhong Li，et al.Integrated Profiling of MicroRNAs and mRNAs：MicroRNAs Located on Xq27.3Associate with Clear Cell Renal Cell Carcinoma［J］.Org，2010，5（12）：1.

［3］Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method［J］.Nat.Protoc，2008，3（6）：1101.

［4］张 骞，金 杰，陶 谦.抑癌基因甲基化在肾细胞癌研究中的新进展［J］.癌症，2007，26（11）：1276.

［5］Lihong Weng，Xiwei Wu，Hanlin Gao，et al.MicroRNA profiling of clear cell renal cell carcinoma by whole-genome small RNA deep sequencing of paired frozen and formalin-fixed，paraffin-embedded tissue specimens［J］.Journal of Pathology，2010，222：41.

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Research on Abnormal Expression of miR-452in Clear Cell Renal Cell Carcinoma

LULi-hua，WUJin-bin，YUZhendong，etal.（ClinicalLabratoryofPekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China）

ObjectiveTo investigate the differential expression level of miR-452in tissue samples of clear cell renal cell carcinoma.Furthermore，we attempt to explore the biological effects of miR-452in the process of renal cell carcinoma.MethodsThe total RNAs were isolated from human clear cell renal cell carcinoma and matched adjacent normal tissues of 20patients with clear cell renal cell carcinoma.RT was performed firstly to get the cDNAs，then qPCR was used to detect the expression level of miR-452in samples above and then the relationship was analysed between the altered miR-452and the clinical pathologic characteristics of patients with clear cell renal cell carcinoma.ResultsCompared with the matched adjacent tissues，miR-452was significantly high expression in clear cell renal cell carcinoma tissues.MiR-452was up-regulated 4.69folds on average than adjacent tissues.However，the expression level of miR-452 had no correlation with the clinical pathologic characteristics of patients with renal cell carcinoma.ConclusionMiR-452 was significantly high expression in tissues of clear cell renal cell carcinoma.This suggested miR-452might be as a key oncogene closely related with the occurrence and development of renal cell carcinoma and maybe served as a potential tumor marker of renal cell carcinoma，and provided a novel target for the early diagnosis and therapy of renal cell carcinoma.

MiR-452；Clear cell renal cell carcinoma；Pathologic characteristic

R737.11

A

1007－4287（2012）02－0237－04

国家自然科学基金（30900817）、深圳市科技计划项目（201102006）、深港创新圈计划（ZYB200907080110A）、广东省科技计划项目（2011B031800381）

＊通讯作者

2010－10－21）