亓莹

耐药结核病已成为结核病防控、治疗工作面临的严峻挑战。目前耐药结核病的诊断主要依靠结核分枝杆菌培养、药物敏感性实验，试验周期长，不能满足临床需要。异烟肼、利福平作为一线抗结核药物，其耐药性分子机制的研究成为热点。有报道指出结核分支杆菌对异烟肼耐药是由结核分支杆菌中过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的突变所致，与inhA基因突变也存在着密切联系。我们采用PCR扩增、核酸杂交检测方法对102株临床结核杆菌分离株和35例结核患者菌阳痰标本进行KatG、inhA基因突变检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 42株对异烟肼敏感的菌株，60株对异烟肼耐药菌株、35例耐异烟肼或含耐异烟肼的肺结核患者菌阳菌阳痰标本来自我院就诊的结核患者。异烟肼敏感株、耐药株均通过结核分枝杆菌药物敏感性试验验证。

1.2 方法

1.2.1 结核分枝杆菌DNA模板的制备 刮取少量标本，加入100ulTE中，100℃ 煮沸10min，立即置于冰上2min，10000rpm离心10min，取上清备用。

1.2.2 PCR扩增 采用20ul反应体系，Bio-标记引物，扩增程序为:经过变性、退火、延伸，30次循环，最后延伸72℃、10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(10ug/ml)。凝胶成像系统检测，出现267 bp条带。

1.2.3 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素杂交膜装入杂交袋中，加入杂交液进行预杂交:45℃、20min。将上一步PCR扩增阳性产物95℃、10min变性，取出迅速放入冰盒中，取变性扩增产物加入杂交袋中，每ml杂交液加l5ul变性的扩增产物，进行分子杂交:45℃、60 min。取出硝酸纤维素杂交膜，洗膜三次、加入显色试剂显色、与标准菌株对比观察报告结果。……