位争伟 姜恩林 周燕

1 资料与方法

1.1 一般资料 以下所有材料均为正规公司及正规部门提供，所需材料为:细胞培养基、海藻酸钠3 d支架、SD大鼠5只(每只质量约为200 g)、鼠抗人CK14、鼠抗人CK15、山羊抗小鼠、扫描电镜、细胞培养箱，以及倒置显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 对细胞的培养 选择全层头皮组织(越新鲜越好)，使用酶消化以及组织块的方法分别对其进行分离，然后得到ORSC，培养P-L-L包被后，采用无血清法对K-SMF培养基进行培养，实验所用的均为原代细胞。采用酶消化法来获得DPC，采用10%DMEM含量的培养基进行培养，实验所用的均为第三代实验用细胞。

1.2.2 构建毛囊培养模型 分别将所获得的原代ORSC以及三代内的DPC收集在MSCM中，第一步，将两种细胞的浓度分别进行调整，按照1比5的比例调匀后放置一边备用;第二步，海藻酸钠3 d支架的准备，为了保证该支架在力学上的性能，在对支架的使用之前，先为其添加一种Firming Buffer含量为10%的溶液，这样可以有效加强支架的抗牵拉力以及弹性［1］;第三步，种子细胞的接种，将第一步中准备好的溶液均匀注射入第二步中准备好的支架表面，当MSCM培养溶液将支架浸没以后，将其放置在37℃的培养箱进行培养，每两天进行一次溶液的置换。三个礼拜以后，为其进行液-气界面之间的培养，培养四个礼拜。培养到第四个礼拜的时候，用甲醛含量为10%的溶液将一部分支架固定，采用石蜡的切片进行HE染色，并采用光镜对支架的表面进行观察，另外一部分则进行SD大鼠的皮下移植，以进行体内实验。……