卢创新 崔瑶 李晓燕 周云

己糖激酶(Hexokinase，H K-Ⅱ)是肿瘤组织中糖酵解的限速酶，它在肿瘤组织中表达的量及活性的增加，使得肿瘤组织在乏氧的情况下为瘤细胞本身的生长和增生提供必需的能量［1］。槲皮素具有广谱的抗肿瘤作用，但其促肿瘤细胞凋亡机制尚未完全明确。本研究旨在对槲皮素促进结肠癌SW480细胞的凋亡机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌SW480细胞株由本实验室保存。RPM I-1640培养液，美国Hyclone;胎牛血清购自Gibico公司，噻唑蓝(MTT)、Annixin-v、PI购自 Sigma公司;槲皮素购于哈药集团制药六厂;羊抗HK-Ⅱ多克隆抗体购自santa cluz，S-P试剂盒购于北京中杉金桥。

1.2 细胞培养与药物处理 采用人结肠癌SW480细胞系，于37℃、5%CO2饱和温度培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3 d传代一次。槲皮素在培养中的终浓度分别为12.5 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L。空白对照组不加药，以等量培养液代替。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 将对数生长的人结肠癌细胞，2 ml/孔接种于6孔板，分别加入槲皮素组和对照组各处理组试剂，继续培养24 h，收集各处理组细胞，用PBS洗涤细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，分别加入5 μL AnnexinV/FITC和P I 10 μL，旋涡混匀，室温避光染色15 min，进行流式细胞仪的观察和检测。

1.4 细胞免疫化学 常规制作细胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定。按免疫组化SP法步骤进行，用PBS代替一抗作为阴性对照。己糖激酶主要在胞浆表达，呈棕黄色，空白对照呈阴性。200倍镜下随机取5个视野，计算每个视野阳性细胞数，阳性反应者用德国LeicaQ550 cw图像分析系统在统一光强，统一放大倍数(200)下测量表达情况，以染色最淡的视野为起点，随机选取视野测定其灰度值作为阳性表达的量化指标，并进行统计学分析。

2 结果

2.1 不同药物组对SW480细胞凋亡的影响 选择槲皮素的5个浓度组进行实验，各组药物分别作用SW480细胞48 h，发现各浓度组槲皮素诱导SW480细胞凋亡能力均高于空白对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并随浓度升高而逐渐升高(P＜0.05)。

2.2 槲皮素作用前后SW480细胞中己糖激酶蛋白表达的比较 正常己糖激酶蛋白主要在胞浆表达，呈棕黄色均匀染色为阳性表达。对己糖激酶表达阳性的样本行图像分析，测其灰度值作为其表达强度的量化指标。灰度值与实际表达强度成反比。己糖激酶在槲皮素作用48 h后，随槲皮素浓度升高而表达强度逐渐下降，与空白对照相比均具有统计学差异(P＜0.05)。

3 讨论

恶性肿瘤细胞中糖酵解活跃，依靠糖酵解获取能量是其主要的能量获取方式［2］。高糖酵解与线粒体结合型HKI、HKII高表达相关。实验证实在四种HK的同工酶中，HKⅡ与肿瘤相关性最大。肿瘤细胞中高水平线粒体结合型HKII能抑制肿瘤细胞凋亡，从而继续生长增殖。肿瘤特征性的糖代谢酶类，就像肿瘤中其他的调节因子一样，也引起了人们的关注。从一定程度地抑制或影响这类调节因子，可以影响肿瘤的能量代谢，而正常细胞不受影响。因此，针对HK-Ⅱ的治疗可能为治疗高葡萄糖代谢肿瘤提供一个新的策略。通过RNA干扰技术沉寂基因表达来抑制HK-Ⅱ的合成，其可行性及有效性已获得实验证实。

从既往实验室研究来看，槲皮素都显示出一定的抗癌效果，多通过提升自身免疫力来发挥治疗作用［1，2］，对正常组织的损失很小。若能证实其具有直接的抗肿瘤作用，将有较大意义，可为结肠癌等实体瘤的治疗提供有益的方法和实验依据。在本实验中研究发现，槲皮素具有诱导结肠癌SW480细胞的凋亡的能力，并随浓度升高而增强，在此过程，己糖激酶的表达水平受到影响，并随槲皮素的浓度升高而表达下降，可以推测，正是槲皮素抑制了己糖激酶的表达，使得肿瘤细胞的糖酵解正常程序陷入紊乱，进而诱发了凋亡信号通路，促进其凋亡。但是，槲皮素抑制结肠癌SW480细胞中己糖激酶表达的机制，尚需进一步的实验研究。

［1］吴平安，李国华.HK-Ⅱ与肿瘤关系的研究进展.实用临床医学，2009，10:133-134.

［2］Wilson J E.Hexokiunses.Bey Physiol Biochem Pharmacol，1995，126:65-198.

［3］张军晖，邢念增，康宁，等.槲皮素对TRAMP-C2前列腺癌细胞的抑制作用.中华实验外科杂志，2006，23(10):1240-1241.