区奕猛 唐亨力 罗永平 余炯标

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，随着对此疾病的认识的提高，已能较早期的得到诊治，约90%的患者在初次治疗时无远处转移征象，但是仍有约24%经常规检查没有发现任何转移迹象(包括淋巴结转移)的患者将于术后出现复发和转移而导致治疗失败。骨髓和骨是乳腺癌最易发生转移的部位，其发生率可高达80%以上。近年来，对乳腺癌患者处于亚临床阶段的骨髓微转移的检测越来越受到肿瘤学家的重视［1］。本研究应用细胞角蛋白19 cK-l9 mRNA表达水平检测其骨髓微转移情况，并对比研究新辅助化疗对骨髓微转移的影响，以指导日后的诊治工作。

1 资料与方法

1.1 骨髓血标本 我院2010～2012年手术治疗的乳腺癌患者63例，年龄33～70岁，平均(46±8)岁，均于术前及术后1个月左右于髂前上棘处抽取骨髓血标本及进行外周血中CKl9 mRNA水平检查。

1.2 方法

1.2.1 骨髓微转移的检测 采用ABC免疫组织化学染色法，EMA、CK19单克隆抗体及试剂盒均购自美国DA KO公司。EMA、CK19抗体稀释浓度均为1∶50，染色阳性为棕黄色，EMA蛋白表达于细胞膜，CK19蛋白表达于细胞浆。微转移阳性的判断标准:① EMA阳性或CK19阳性。② 细胞核大，染色深，核浆比例失调等异形表现［2］。取外周血5 ml，为抗凝加少量的EDTA(1 mg/m1)，生理盐水稀释2倍，借助淋巴细胞分离液将淋巴细胞分离完全，提取细胞总RNA［3］。并设计CKl9的引物和探针。反应体系50μl，在分析仪上对标本、阳性对照、阴性对照和标准品进行扩增和分析。采用Bieche的标准曲线制备方法，线性范围:1022～1066/ml。仪器根据标准曲线自动计算出标本中CKl9的拷贝数/ml，GAPDH的拷贝数/ml，CKl9/GAPDH比值。

1.2.2 新辅助化疗 经穿刺或切除活检明确诊断的患者，根治手术前给予新辅助化疗(CEF方案:环磷酰胺500 mg/m2+表阿霉素60 mg/m2+5-氟尿嘧啶500mg/m2静脉滴注治疗两个疗程);其余患者围手术期未给予抗肿瘤药物治疗。

1.3 统计学处理 用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有显著意义。

2 结果

63例乳腺癌患者检出骨髓微转移阳性20例，阳性率30.16%。病理分型:浸润性导管癌54例、浸润性小叶癌6例，低分化腺癌2例，管状腺癌1例。临床分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期45例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。骨髓微转移情况与病理类型、年龄、绝经与否及淋巴结转移情况无相关性，与临床分期明显相关.有腋窝淋结转移者骨髓微转移阳性率为35.0%(17/48)，无腋窝淋巴结转移者骨髓微转移阳性率为20.0%(3/15);两者比较，无显著性差异(P＞0.05)。20例骨髓微转移阳性患者接受新辅助化疗后阴性或弱阳性者14例，转阴率达70.0%。

3 讨论

文献统计表明，骨及骨髓是乳腺癌最易发生转移的部位之一，并常与其他部位的转移伴发。乳腺癌为上皮性肿瘤，具有上皮性来源的细胞生物学特征，而骨髓属间叶组织细胞，不表达上皮性抗原，故可应用针对上皮性抗原相应的单克隆抗体(如本研究所用的EMA、CK19)进行免疫组化染色，出现染色阳性细胞，再结合阳性细胞所具备的恶性特征，则很容易做出骨髓微转移的诊断［2］。利用免疫组化染色法检测乳腺癌骨髓微转移有一定局限性，而肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，均可能影响对转移细胞的正确评判，因此，在实际应中，应尽量选2种以上不同的单克隆抗体(针对胞膜和胞质的抗原尤佳)，对组化染色阳性细胞进一步观察其形态特征，最后方可诊断骨髓微转移。本研究所选用的克隆抗体EMA、CK19就是分别针对胞膜及胞质的抗原，并结合阳性细胞的恶性特征做出骨髓微转移判断，从而确保了骨髓微转移检测的准确性。资料表明，骨髓微转移的检测对预测乳腺癌的复发、转移有重要的意义。本研究采用免疫组化SP法，乳腺癌骨髓微转移阳性检出率达30%，而且临床分期较晚的患者，骨髓微转移率明显较高，在一定程度上预示了预后的不佳。临床Ⅰ期的患者阳性检率达20%，这与乳腺癌是一种全身性疾病理论相一致，也与其他肿瘤学专家研究结论相近。本研究重点对阳性检出患者行C饿F方案的新辅助化疗2个周期试验，转阴率达70.0%，取得了理想效果，说明了含蒽环类的联合化疗对乳腺癌的治疗效果也是一个很好的体内药敏试验依据。如果结合肿瘤缩小的程度，其对术后化疗方案选择及日后疗效都有很好的应用前景，尤其在目前保乳手术逐渐普及的情况下，更有指导价值，而对于未能转阴的患者，提供了更换化疗方案的依据1982年Frei提出了新辅助化疗的概念，即对于肿瘤诊断明确的患者在术前就应用辅助化疗，以提高综合治疗效果。近十余年来国内外已就乳腺癌的新辅助化疗开展了较多的研究，据有关报道，新辅助化疗对乳腺癌的总有效率可达65% ～90%［3，4］。理论上分析，有效的新辅助化疗不仅能控制肿瘤的生长，更能控制全身亚临床病灶，因此应该能抑制乳腺癌患者的骨髓微转移。我们通过对比研究，对术前明确诊断的患者应用新辅助化疗，使患者术后骨髓微转移率明显降低，有显著的统计学意义，提示新辅助化疗可能在控制肿瘤生长的同时，抑制了肿瘤的微转移，从而对预防乳腺癌患者术后的转移和复发起重要作用。本研究采用经典的CEF方案，取得较为满意的效果。但是，这些药物是否通过更有效的抑制肿瘤的微转移而取得更好的疗效，还有待进一步对比研究。

［1］ 袁梵，徐兵河.乳腺癌骨髓微转移的检测及意义.国外医学肿瘤学分册，2002，29:2832286．

［2］ 张杰，沈坤炜，吴炅，等.乳腺癌患者骨髓微转移细胞表型及骨髓血uPA活性的研究.中华普通外科杂志，2002，17:6082610．

［3］ Ozbas S，Dafydd H，Purushot ham AD.Bonemarrow micrometas2 tasis in breast cancer.Br JSurg，2003，90:2902301．

［4］ Montemurro F，Aglietta M.Selected highlight s f rom the26th San Antonio Breast Cancer Symposium.December 326，2003，San Antonio，TX，USA.Expert Opin Pharmacother，2004，5:9812 989．