犬瘟热诊断技术

一、范围

本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的操作方法。

二、试剂和材料

2.1 改良最低要素营养液（DMEM）培养基

2.2 非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）

2.3 磷酸盐缓冲液（PBS）

2.4 青霉素、链霉素

2.5 CDV阳性血清：中和抗体效价1·1024。

2.6 CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清。

2.7 本科结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白（SPA）。

2.8 底物溶液

2.9 过氧化氢甲醇溶液

2.10 盐酸酒精溶液

2.11 胰蛋白酶溶液

2.12 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，-20℃保存。

2.13 逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为5U/μL，-20℃保存。

2.14 RNA酶抑制剂（40U/ μL）：-20℃保存。

2.15 dNTP：含dATP、dGTP、dTTP各10mmol/L, -20℃保存。

2.16 引物：浓度为20μmol/L,其序列如下：

上游引物（CDVR）：5'CGA GTC TTT GAG ATA GGG TT3'

下游引物（CDVR）：5'CCT CCA AAG GGT TCC CAT GA3'

随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为5U/μL，-20℃保存。

DEPC水：自配或购买商品化DEPC水。

Trizol试剂：4℃保存。

异丙醇：使用前预冷至-20℃。

75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至于20℃。

1.5mL无RNA酶的Eppendorf管。

0.2mL无RNA酶的PCR薄壁管。

三、器材和设备

3.1 细胞培养瓶（中号瓶）

3.2 二氧化碳培养箱

3.3 恒温水浴箱（5℃～100℃）

3.4 普通光学显微镜

3.5 0.45μm微孔滤膜

3.6 离心机

3.7 PCR扩增仪

3.8 水平电泳仪

3.9 40个小孔的室玻片

3.10 冷冻切片机

3.11 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上

3.12 凝胶成像系统

四、临床检查

4.1 临床症状

4.1.1 病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。

4.1.2 腹下可见米粒大丘疹。

4.1.3 病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。

4.2 病理变化

4.2.1 新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩；成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。

4.2.2 表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。……