任晋可，李春海，叶 伟

椎间盘退变性疾病，如颈椎病、腰椎间盘突出症等是骨科的常见病、多发病。这类疾病的共同病理基础是椎间盘退变，研究椎间盘退变的发生发展过程，探寻各种因素对椎间盘退变的作用机制，对寻找更好的防治手段、提高椎间盘退变患者的生命质量具有重大意义。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是诱导低氧基因修复细胞有氧内环境的调节因子，近年来其在椎间盘退变过程中的调控作用受到关注。

1 椎间盘的营养途径

椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板3部分组成，是人体中最大的无血管组织。营养通路主要有终板途径和纤维环途径：椎体内的血管不断分支，在软骨终板下骨质形成血管袢，包括氧气在内的绝大部分营养物质通过这些血管袢经扩散作用透过软骨终板、椎间盘基质，最终到达内部的椎间盘细胞，而乳酸等代谢废物经过相反途径排出，此即终板途径，Du等[1]通过动态增强MRI清楚观察到这一现象；小部分营养物质通过分布到最外层纤维环的血管末梢来提供养分，即纤维环途径[2-3]。但随着机体的老化，供应椎间盘周围的血管数量减少，软骨终板逐渐钙化，氧气等营养物质的供应及代谢废物的排除受到阻滞[2]，椎间盘内逐渐形成缺氧微环境。这种微环境对椎间盘退变的发生发展如何产生影响，椎间盘退变是否与HIFs有关，这些都成为近年来学者们研究的重要课题。

2 HIFs的分类与功能

HIFs为一类介导哺乳动物细胞内低氧反应的核转录复合体，其表达增加是缺血、缺氧早期首发的分子水平的适应性反应。HIFs能调控下游多种靶基因的表达，在改善组织缺血、缺氧等方面具有深远意义[4-6]。

目前，哺乳动物体内发现3种HIFs，即HIF-1、HIF-2和HIF-3。HIF-1和HIF-2以异源二聚体的形式存在，由α和β亚单位组成，广泛表达于哺乳动物组织结构（如心、脑、骨骼肌、肾等）中，是细胞在缺氧应答反应中最重要的调节因子。HIF-1、HIF-2的活性主要分别由HIF-1α和HIF-2α决定[7-9]，它们可调控促红细胞生成素、酪氨酸羟化酶、葡萄糖转运体1、糖酵解酶、血管内皮生长因子等一系列缺氧诱导基因的表达。但两者的具体功能有所不同，甚至相反[7-8]。在常氧条件下，HIF-1和HIF-2表达均较低；但在低氧处理后，HIF-1和HIF-2的表达均明显增加。HIF-3于1998年由Gu[10]等首先发现，目前国内外研究较少，其功能尚不明确。

3 HIFs在椎间盘组织中的表达

2002年，Rajpurohit等[11]首次报道在大鼠胸、腰椎间盘髓核中有HIF-1α的表达；髓核、纤维环和软骨终板中有HIF-1β表达，且在髓核中表达较高；而后，Risbud等[12]发现，人、大鼠和绵羊的颈、腰椎间盘髓核细胞在正常氧浓度（21%）及低氧环境（2%）下均表达HIF-1α；Richardson等[13]则发现，HIF-1α在人正常与退变腰椎间盘纤维环和髓核组织中均有表达。

4 HIFs对椎间盘细胞外基质的调控

近年来，有关HIFs对椎间盘细胞外基质作用的研究较多[12-16]。Agrawal等[14]的研究结果表明，在大鼠髓核中，HIF-2α通过一种p300结合蛋白-cited2来调节血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达及转录活性；之后，Skubutyte等[15]发现，在大鼠胚胎和成年人腰椎间盘中有ANK（一种能控制无机焦磷酸盐转运的多通道跨膜通道）的表达，而HIF-1和HIF-2可调控ANK的表达，这提示HIF-1和HIF-2可能通过调控ANK表达对髓核细胞矿物盐的沉积造成影响；2011年，Gogate等[16]发现，大鼠腰椎间盘髓核细胞中调控葡萄胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的限速酶β-1，3-葡萄糖醛酸转移酶 1（β-1，3-glucuronyltransferase 1，β-1，3-GlcAT-1）的表达受到 HIF-1α和HIF-2α的调节，而GAG所参与形成的结构对脊柱生物力学有重要影响，这也间接说明HIFs可能通过GAG发挥对脊柱生物力学的调控作用。

5 HIFs与椎间盘细胞凋亡、自噬

众所周知，椎间盘的退变不仅涉及基质的改变，更表现在细胞的变化，如死亡等[17]。对于HIFs功能的研究，也不仅仅局限于对细胞外基质的影响，与多种细胞凋亡、自噬的关系是近年来研究的另一重要方向。

5.1 HIFs与椎间盘细胞凋亡

凋亡是由基因介导的一种程序性细胞死亡方式，又名Ⅰ型细胞死亡。细胞依靠凋亡来主动引起对自身的破坏。大量研究结果表明，凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病等[18-19]，近年来的研究结果也显示其与椎间盘退变关系密切[20]。Zhao等[20]指出，椎间盘细胞的程序性死亡导致了椎间盘基质的退变，两者之间存在先因后果的关系。Zeng等[21]发现，HIF-1α可促进半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）表达，而Gal-3能够抑制FasL介导的鼠腰椎间盘髓核细胞的凋亡进程，由此认为HIF-1可能具有抑制髓核细胞凋亡的作用；从这种意义上讲，HIFs可能是通过抑制椎间盘细胞凋亡过程而对椎间盘退变过程造成影响。但也有学者持不同观点并得出不同结论，Ha等[22]认为椎间盘细胞凋亡对于维持椎间盘组织的内稳态有积极作用，是对椎间盘的一个有利因素，他们研究3组（包括非包容型突出组9例、包容型突出组6例、正常对照组5例）患者腰椎间盘组织中HIF-1的表达量，结果显示，非包容型突出患者椎间盘中HIF-1α的表达量及细胞凋亡数更多，且相关分析结果表明HIF-1α的表达水平与细胞凋亡程度呈正相关，他们由此认为HIF-1可能有助于维持椎间盘的内稳态。

5.2 HIFs与椎间盘细胞自噬

自噬又称“细胞自食”，是指膜（大部分表现为双层，有时也为单层或多层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，并与内涵体形成所谓的“自噬内涵体”，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬与凋亡有着复杂的关系，两者共用相同的刺激蛋白和调节蛋白，但诱发阈值和条件不同，相互之间如何进行转换和协调目前尚不十分清楚。在某些情况下，自噬能够抑制凋亡，使机体适应外界刺激；而在另外一些情况或因素的刺激下，自噬也会导致细胞死亡（Ⅱ型细胞死亡）[23]。目前，许多研究结果均表明，自噬在肿瘤、神经退行性疾病、免疫性疾病等多种疾病的发病中有着重要作用[24-26]。

Bohensky等[27]发现，HIF-1同时调控软骨细胞的凋亡与自噬，并通过调节自噬相关蛋白如Beclin-1、LC3的表达来抑制凋亡；但持续的自噬又将促进细胞死亡。Carames等[28]的研究结果表明，自噬在骨性关节炎等疾病中对软骨起到保护作用。Srinivas等[29]发现，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）参与软骨细胞自噬进程，而后的研究进一步证实该自噬进程是HIF-1α依赖性的，即HIF-1α通过AMPK、mTOR对软骨细胞自噬进行调控[30]。Bohensky等[31]的研究结果还显示，HIF-2α的表达受到抑制后，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，Akt）、mTOR活性降低，BCL-xL表达降低，HIF-1α表达升高，软骨细胞自噬增加。

髓核细胞与软骨细胞形态相似，同时还能表达软骨细胞的两种主要标志物——Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，因此髓核细胞又被称为类软骨细胞[32]。Ye等[33]利用电子显微镜首次发现不同年龄SD大鼠腰椎间盘髓核细胞中均有自噬体的表达，且随年龄增加而呈增加趋势；Western blotting检测结果则显示，SD大鼠腰椎间盘组织中的自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随年龄增加而上升，表明椎间盘细胞自噬是在不断增加的[34-35]。朱伟荣等[36]用EBSS液饥饿诱导处于对数生长期的腰椎间盘纤维环细胞，结果显示，随着饥饿时间的延长，单丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine,MDC）阳性细胞数及自噬泡数量增多，LC3-ⅡmRNA表达增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增多，Beclin-1 mRNA及蛋白表达增高。随后，Ye等[37]发现，内质网应激可能是椎间盘细胞自噬的重要诱发因素。Shen等[38]的研究结果证实，白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）能以剂量依赖的方式上调血清剥夺诱导的SD大鼠腰椎间盘纤维环细胞自噬，并认为自噬可能在纤维环细胞和椎间盘退变进程中以抗凋亡的方式起保护作用。这些证据提示自噬很可能参与椎间盘退变进程，但它是否受HIF调控尚未可知。

综上所述，缺氧可诱导椎间盘组织中HIFs表达，HIFs与椎间盘中VEGF的表达和转录活性、矿物盐的沉积以及椎间盘细胞的凋亡等有关；HIFs还具有调控软骨细胞自噬的功能，椎间盘细胞中亦存在自噬现象，但椎间盘细胞的自噬是否受HIFs的调控，以及其可能的调控机制，其在椎间盘退变进程中是否起到关键作用，都需要进一步深入的研究，以便为椎间盘退变的治疗开辟新思路和新途径。

[1]Du H,Ma SH,Guan M,et al.Dynamic contrast enhancedmagnetic resonance imaging study of the nutrition pathway for lumbar intervertebral disk cartilage of normal goats[J].Orthop Surg,2011,3(2):106-112.

[2]Grunhagen T,Shirazi-Adl A,Fairbank JC,et al.Intervertebral disk nutrition:a review of factors influencing concentrations of nutrients and metabolites[J].Orthop Clin North Am,2011,42(4):465-477.

[3]Urban JP,Smith S,Fairbank JC.Nutrition of the intervertebral disc[J].Spine,2004,29(23):2700-2709.

[4]Bekeredjian R,Walton CB,MacCannell KA,et al.Conditional HIF-1alpha expression produces a reversible cardiomyopathy[J].PLoS One,2010,5(7):e11693.

[5]Xue W,Cai L,Tan Y,et al.Cardiac-specific overexpression of HIF-1 alpha prevents deterioration of glycolytic pathway and cardiac remodeling in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Am J Pathol,2010,177(1):97-105.

[6]Arany Z,Foo SY,Ma Y,et al.HIF-independent regulation of VEGF and angiogenesis by the transcriptional coactivator PGC-1alpha[J].Nature,2008,451(7181):1008-1012.

[7]Eubank TD,Roda JM,Liu H,et al.Opposing roles for HIF-1alpha and HIF-2alpha in the regulation of angiogenesis by mononuclear phagocytes[J].Blood,2011,117(1):323-332.

[8]Zhu GQ,Tang YL,Li L,et al.Hypoxia inducible factor 1alpha and hypoxia inducible factor 2alpha play distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2010,16(19):4732-4741.

[9]Carmeliet P,Dor Y,Herbert JM,et al.Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated apoptosis,cell proliferation and tumour angiogenesis[J].Nature,1998,394(6692):485-490.

[10]Gu YZ,MoranSM，HogeneschJB,etal.Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit,HIF3alpha[J].Gene Expr,1998,1(3):205-213.

[11]Rajpurohit R,Risbud MV,Ducheyne P,et al.Phenotypic characteristics of the nucleus pulposus:expression of hypoxia inducing factor-1,glucose transporter-1 and MMP-2[J].Cell Tissue Res,2002,308(3):401-407.

[12]Risbud MV,Guttapalli A,Stokes DG,et al.Nucleus pulposus cells express HIF-1 alpha under normoxic culture conditions:a metabolic adaptation to the intervertebral disc microenvironment[J].J Cell Biochem,2006,98(1):152-159.

[13]Richardson SM,Knowles R,Tyler J,et al.Expression of glucose transporters GLUT-1,GLUT-3,GLUT-9 and HIF-1alpha in normal and degenerate human intervertebral disc[J].Histochem Cell Biol,2008,129(4):503-511.

[14]Agrawal A,Gajghate S,Smith H,et al.Cited2 modulates hypoxia-inducible factor-dependentexpression ofvascular endothelial growth factor in nucleus pulposus cells of the rat intervertebral disc[J].Arthritis Rheum,2008,58(12):3798-3808.

[15]Skubutyte R,Markova D,Freeman TA,et al.Hypoxiainducible factor regulation of ANK expression in nucleus pulposus cells:possible implications in controlling dystrophic mineralization in the intervertebral disc[J].Arthritis Rheum,2010,62(9):2707-2715.

[16]Gogate SS,Nasser R,Shapiro IM,et al.Hypoxic regulation of beta-1,3-glucuronyltransferase 1 expression in nucleus pulposus cells of the ratintervertebraldisc:role of hypoxia-inducible factor proteins[J].Arthritis Rheum,2011,63(7):1950-1960.

[17]Urban JP,Roberts S.Degeneration of the intervertebral disc[J].Arthritis Res Ther,2003,5(3):120-130.

[18]Wong RS.Apoptosis in cancer:from pathogenesis to treatment[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,(30):87.

[19]Nagata S.Apoptosis and autoimmune diseases[J].Ann N Y Acad Sci,2010,(1209):10-16.

[20]Zhao CQ,Jiang LS,Dai LY.Programmed cell death in intervertebral disc degeneration[J].Apoptosis,2006,11(12):2079-2088.

[21]Zeng Y,Danielson KG,Albert TJ,et al.HIF-1 alpha is a regulator of galectin-3 expression in the intervertebral disc[J].J Bone Miner Res,2007,22(12):1851-1861.

[22]Ha KY,Koh IJ,Kirpalani PA,et al.The expression of hypoxia inducible factor-1alpha and apoptosis in herniated discs[J].Spine,2006,31(12):1309-1313.

[23]Maiuri MC,Zalckvar E,Kimchi A,et al.Self-eating and self-killing:crosstalk between autophagy and apoptosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(9):741-752.

[24]Choi KS.Autophagy and cancer[J].Exp Mol Med,2012,44(2):109-120.

[25]Son JH,Shim JH,Kim KH,et al.Neuronal autophagy and neurodegenerative diseases[J].Exp Mol Med,2012,44(2):89-98.

[26]Pierdominici M,Vomero M,Barbati C,et al.Role of autophagy in immunity and autoimmunity,with a special focus on systemic lupus erythematosus[J].FASEB J,2012,26(4):1400-1412.

[27]Bohensky J,Shapiro IM,Leshinsky S,et al.HIF-1 regulation of chondrocyte apoptosis:induction of the autophagic pathway[J].Autophagy,2007,3(3):207-214.

[28]Carames B,Taniguchi N,Otsuki S,et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage,and its agingrelated loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis Rheum,2010,62(3):791-801.

[29]Srinivas V,Bohensky J,Shapiro IM.Autophagy:a new phase in the maturation of growth plate chondrocytes is regulated by HIF,mTOR and AMP kinase[J].Cells Tissues Organs,2009,189(1-4):88-92.

[30]Bohensky J,Leshinsky S,Srinivas V,et al.Chondrocyte autophagy is stimulated by HIF-1 dependent AMPK activation and mTOR suppression[J].Pediatr Nephrol,2010,25(4):633-642.

[31]Bohensky J,Terkhorn SP,Freeman TA,et al.Regulation of autophagy in human and murine cartilage:hypoxia-inducible factor2 suppresseschondrocyte autophagy [J].Arthritis Rheum,2009,60(5):1406-1415.

[32]Clouet J,Grimandi G,Pot-Vaucel M,et al.Identification of phenotypic discriminating markers for intervertebral disc cells and articular chondrocytes[J].Rheumatology,2009,48(11):1447-1450.

[33]Ye W,Xu K,Huang D,et al.Age-related increases of macroautophagy and chaperone-mediated autophagy in rat nucleus pulposus[J].Connect Tissue Res,2011,52(6):472-478.

[34]叶伟,梁安靖,彭焰,等.LAMP2A和MEF2D在增龄过程中大鼠髓核组织的表达及其意义[J].中华实验外科杂志,2010,27(11):1615-1617.

[35]叶伟,褚忠华,徐康,等.大鼠增龄过程中髓核组织Beclin-1和微管相关蛋白轻链3的表达及其意义[J].中华实验外科杂志,2010,5(3):643-645.

[36]朱伟荣,叶伟,徐康,等.饥饿诱导对纤维环细胞自噬因子LC3和Beclin-1表达的影响[J].中华实验外科杂志,2011,28(6):983-985.

[37]Ye W,Zhu W,Xu K,et al.Increased macroautophagy in the pathological process of intervertebral disc degeneration in rats[J/OL].Connect Tissue Res.[Aug 28].http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/03008207.2012.715702.[Aug 23]

[38]Shen C,Yan J,Jiang LS,et al.Autophagy in rat annulus fibrosus cells:evidence and possible implications[J].Arthritis Res Ther,2011,13(4):R132.