王传禹，常志顺，杨 斌，杨向东

(1.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224;2.昆明云岭广大种禽饲料有限公司，云南 昆明 650215)

鸡大肠杆菌病是由某些致病血清型或条件性致病大肠杆菌引起的不同疾病的总称，在集约化鸡场已成为危害鸡群的主要疾病之一。临床上表现为败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、全眼球炎、脑炎等，发病率高，死亡率高，且因与其它呼吸道疾病(如慢性呼吸道疾病)混合或继发感染而使死亡率升高。在产蛋母鸡，可发生腹腔内的大肠杆菌感染，发展成为卵黄性腹膜炎。

2011年7月，昆明某蛋鸡场罗曼褐育成鸡4 500只，产蛋鸡4 200只，相继发生以下痢、呼吸困难、眼球炎和产蛋率下降为特征的疾病。育成鸡从60日龄开始陆续发病，病鸡精神萎顿，多数出现呼吸困难，有啰音，腹泻，粪便呈灰绿色，脚软，站立不稳，部分眼睑肿胀，角膜混浊，最后失明，3～7 d死亡，病死率约为9%;产蛋鸡从210日龄开始陆续发病，产蛋率迅速下降5%，病鸡多精神沉郁，食欲减退，腹部膨大，粪便灰绿色或黄色，多经1～2周死亡，病死率约为3%。病死鸡剖检病理变化表现为典型的气囊炎、肝周炎、心包炎，卵巢变形、卵泡破裂，腹腔内充满卵黄液并引起腹膜炎致使肠粘连，卵黄凝固，气味恶臭。无菌采取病死鸡肝脏等样品，进行实验室检查，确定鸡群为大肠杆菌感染。通过药敏试验筛选出敏感药物和利用大肠杆菌分离株制备自家灭活菌苗用于鸡群的治疗和预防，收到满意的效果，现将实验结果与防治情况报告如下。

1 细菌分离与鉴定

1.1 材料

1.1.1 病料

具有大肠杆菌病症状的病死鸡和濒死鸡，剖检采集肝脏组织及卵巢或卵黄、眼球液等组织作为细菌分离的材料。

1.1.2 培养基与试剂

鲜血琼脂培养基、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、营养肉汤，细菌微量生化反应管和药敏纸片为杭州天和生物试剂有限公司生产。

1.1.3 试验动物

购自昆明某鸡场。

1.1.4 血清

禽大肠杆菌标准O因子血清，购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

无菌操作取病死鸡的肝脏、眼球液、卵黄等，划线接种鲜血琼脂平板，置37℃培养箱中培养18～24 h。选择单个菌落接种普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板，符合大肠杆菌的生长特性时，在营养肉汤中增菌培养，37℃培养18 h。

1.2.2 生化试验

取麦康凯琼脂上砖红色单个菌落接种细菌生化微量鉴定管，置37℃培养箱中培养24 h，观察并记录结果。

1.2.3 药敏试验

将分离的菌株，按常规纸片法进行药敏试验，根据抑菌圈直径大小判定其敏感性。

1.2.4 血清学试验

经形态学、培养特性检查和生化试验鉴定为大肠杆菌的，血清型鉴定按中国兽医药品监察所提供的产品使用说明书进行操作。

1.2.5 致病性试验

将分离菌接种营养肉汤，37℃培养18 h，采用比浊法测定细菌含量，调整菌数为1.0×108CFU/mL，皮下接种10日龄雏鸡3只，每只0.5mL;并设对照组3只，皮下注射0.5mL无菌营养肉汤。接种后观察72 h，记录死亡情况，并取肝脾进行细菌分离。对72 h后存活者剖杀，观察病变并做细菌分离。

1.3 结果

1.3.1 分离培养结果

先后共分离获得14株符合大肠埃希氏菌特征的鸡源大肠杆菌，病原菌在鲜血琼脂平板上形成圆形隆起、湿润的大菌落;在普通琼脂平板上菌落为灰白色;在麦康凯琼脂上形成砖红色湿润的菌落;在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色，具有金属光泽的菌落;在普通肉汤中均匀混浊，管底有少量灰白色沉淀，有粪臭味。用革兰氏染色镜检，为革兰氏阴性的小杆菌。分离株用15%甘油血清－70℃保存。

1.3.2 生化试验结果

14株细菌能100%分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，不能分解肌醇，靛基质、MR、硝酸盐试验呈阳性，H2S、V－P、柠檬酸盐试验呈阴性。

1.3.3 血清型鉴定结果

符合大肠杆菌特性的14株细菌纯培养物与大肠杆菌O因子血清做凝集试验，鉴定出3种血清型，其中O78有4株、O161有2株、O4有1株，4株自凝、3株有待于进一步的血清型鉴定。

1.3.4 致病性试验结果

健康雏鸡于接种后6 h普遍出现精神沉郁等症状，12 h后开始出现死亡，72 h内各菌株死亡只数1～3只。死亡率平均66.7%。取死亡或濒死的雏鸡进行解剖取材，进行细菌分离和生化鉴定，回收菌与接种菌一致;对照组健康存活无死亡，未见明显的临床症状及病变。说明分离菌是对雏鸡有致病性的大肠埃希氏菌。

1.3.5 药敏试验结果

分离株对丁胺卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星高度敏感，对庆大霉素、恩诺沙星、妥布霉素中度敏感，对头孢氨苄、强力霉素、新霉素、青霉素、链霉素、红霉素、阿莫西林、氯霉素、罗红霉素不敏感。

2 大肠杆菌自家菌苗的制备与检测

2.1 增菌培养与灭活

将O78、O161、O4血清型菌株纯培养物分别接种鲜血琼脂培养基，37℃培养18 h，用甲醛生理盐水洗下各型菌株琼脂平板上菌苔，备用。取少量菌液做细菌计数，用蒸馏水调整各菌液浓度至50亿/mL和120亿/m L，甲醛终浓度为0.3%，将 O78、O161、O4株菌液按 4∶1∶1 的比例混合，37℃作用 24 h，每隔4 h摇匀一次。

2.2 菌苗制备

Al(OH)3胶佐剂菌苗:将50亿/mL混合菌液按5∶1的比例加入灭菌处理过的铝胶和0.01%硫柳汞，充分摇匀，37℃作用24 h;油佐剂灭活苗:在120亿/mL混合菌液中加2%吐温－80和0.04%硫柳汞摇匀，无菌检验后制成水项，油项和水项按3∶1比例乳化制成油佐剂灭活苗。

2.3 无菌检验

取灭活菌苗少量样品分别接种琼脂平板和肉汤，37℃培养过夜。平板无细菌生长，肉汤呈澄清状态。说明甲醛灭活完全，无活菌检验合格。

2.4 安全性检验

取20只健康鸡，10只肌肉注射铝胶菌苗1mL/只，10只注射油佐剂灭活苗1mL/只，连续观察3 d，鸡无外观症状，无病理变化。说明制备的自家菌苗是安全的。

3 防治措施

3.1 隔离与消毒

隔离弱、病鸡，防止病原进一步扩散，及时清除病死鸡并焚烧深埋，用含碘消毒液喷雾消毒1次/d，连用3 d。

3.2 治疗

全群用氧氟沙星饮水，连用5 d，同时补充多种维生素进行辅助治疗。

3.3 菌苗接种

发病鸡群用铝胶佐剂菌苗+丁胺卡那霉素(10mg/kg)混匀，0.5mL/羽肌肉注射。育成鸡群80～90日龄颈部皮下或肌肉注射油佐剂灭活疫苗，注射剂量为0.5mL/羽。

经采取以上措施，用药第2天病情好转，病死鸡数量明显减少，5 d后鸡群恢复正常。该批育成鸡至产蛋高峰未出现患大肠杆菌的病死鸡。

4 小结与讨论

(1)本实验对鸡场大肠杆菌的分离培养、生化特性、药敏试验、血清学鉴定、动物实验等做了系列研究，并对鉴定的大肠杆菌进行了增菌培养、活菌计数、甲醛灭活，制备了Al(OH)3胶佐剂菌苗和油佐剂灭活苗，对疫苗进行无活菌和安全性检验。根据药敏试验结果用药和接种自家灭活疫苗来治疗及防制该场的大肠杆菌病，取得了良好的效果。再次证明规模养殖场疾病的诊疗通过实验室检查，把实验结果运用于临床和生产，能最经济最有效地治疗和控制疾病。

(2)由于抗生素的不合理使用及大肠杆菌耐药质粒和菌株本身的变异，导致了抗生素防治鸡大肠杆菌病的局限性。如不进行药敏试验，选用抗生素防治大肠杆菌具有很大的盲目性，效果不确定且成本较高。例如有的养殖场鸡大肠杆菌对头孢氨苄高度敏感，对喹诺酮类抗生素耐药，而该场药敏试验结果则恰好相反。在大肠杆菌污染严重的鸡场，使用菌苗对该病进行生物防治，也存在着一定的局限性，这是由于大肠杆菌血清型很多，又极易产生变异，各地的菌株又不尽相同，相互间的免疫原性也有很大差异。因此，建议使用本场菌株制备的自家菌苗来预防鸡的大肠杆菌病。

(3)大肠杆菌病是条件性疾病，只有加强饲养管理、搞好环境卫生、严格消毒，实时对致病性大肠杆菌的监测、进行药物预防和疫苗接种等综合防治措施的应用才是减少或杜绝大肠杆菌病发生的根本方法。