张宸阁，高雯欣，卢卫红

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090;2.黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150010)

孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)是一种石莼科石莼属的大型绿藻，俗称为海白菜、海菠菜、猪母菜、海葛茵等。广泛分布于西太平洋沿海，在我国辽宁、河北、山东和江苏等沿海均有分布，资源十分丰富［1］。其味甘咸，性寒，有降低胆固醇和清热解毒、软坚散结、利水减压的功效。在民间常利用其与其它药用植物配合来治疗中暑、颈淋巴结肿、甲状腺肿、疮疔、急慢性肠胃炎、高血压、水肿和小便不利、喉炎等病症［2－3］。

孔石莼藻体中含有大量多糖，均以杂多糖形式存在，水解后可得到多种单糖，包括鼠李糖、葡萄糖、木糖、三碳糖、褐藻糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖等［2］。孔石莼中含有四种相对分子量的水溶性多糖(151.7、64.5、58.0 和 28.2ku)［4］。有研究显示，孔石莼多糖具有降血脂，抗病毒，抗肿瘤活性，降胆固醇，抗凝血以及治疗心血管疾病等作用［5］。

为了进一步了解不同相对分子量段孔石莼多糖在体内条件下对辐照所致哺乳动物肝组织损伤的抑制作用，为孔石莼多糖用于抗辐射作用提供实验依据。实验以小鼠肝脏组织SOD及MDA活性作为实验依据，对不同相对分子量段孔石莼多糖拮抗辐照致肝组织损伤的作用进行了探索。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孔石莼藻体，采集自大连沿海。昆明种小鼠30只，6～10周龄，体质量18～22g，均为雄性，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。MDA和SOD试剂盒，由南京建成生物公司提供。

1.2 仪器与设备

CLINAC21EX医用电子直线加速器(VARIAN公司，哈尔滨医科大学第四医院提供);微滤膜(0.45μm，0.25μm，上海市新亚净化器件厂);超滤膜(30ku，100ku)、超滤杯(上海市摩速科学器材有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 不同分子量孔石莼多糖的制备

孔石莼藻体粉末经85%乙醇80℃回流3次，离心，取沉淀在40℃下减压干燥，得到脱脂及醇溶性色素的孔石莼藻体。乙醇回流后藻体用20倍蒸馏水于100℃水浴下搅拌提取1h，过滤，取滤液，滤渣再重复提取2次，弃滤渣，合并3次提取的滤液。浓缩后，加入4倍体积95%乙醇进行沉淀，离心，弃上清，得到粗多糖。

通过Sevag法对粗多糖进行脱蛋白，重复2次。经过除蛋白处理后的多糖进行滤纸抽滤处理，之后分别用0.45μm和0.25μm微滤膜进行预处理，以除去浸提液中的大分子物质。

选择30Ku和100Ku两种分子量的超滤膜对预处理后的多糖进行超滤分级，最终将多糖分为≧100Ku分子量、30～100Ku分子量及≦30Ku分子量三种不同分子量段多糖。

1.3.2 模型的建立及肝组织匀浆的制备

将小鼠随机分为≧100Ku分子量多糖组、30～100Ku分子量多糖组、≦30Ku分子量多糖组，以及空白对照组和辐照对照组，每组6只。

对三个不同分子量段组的小鼠分别进行对应分子量段多糖药品灌胃，多糖药品的浓度均为20mg/ml，每天1次，每次0.2mL，连续灌胃21天;空白对照组及辐照对照组灌服等体积蒸馏水。第21天灌胃后，除空白对照组外各组均通过医用电子直线加速器进行4.0Gy剂量辐照。剂量率为1.00Gy/min，照射野为20cm×20cm，皮源距为100cm，辐照后24h颈椎脱臼法处死小鼠。

迅速取出小鼠的肝脏组织，在生理盐水中清洗后置于研钵中，向其中注入少许液氮，用钵杵进行快速研磨，使肝脏组织充分匀浆化。向研钵中加入一定体积的0.86%冷生理盐水，充分混合后转移至离心管，补充生理盐水至加入生理盐水的总体积为肝脏自身重量的9倍，制备成10%的肝组织匀浆。利用离心机以2 000r/min的转速离心10min，弃沉淀取上清备用。

1.3.3 肝脏组织匀浆蛋白含量的测定

肝脏组织匀浆蛋白含量通过考马斯亮蓝法来测定［6］。

试剂配制:1)BSA标准溶液的配制:在100mL蒸馏水中加入20mg BSA，即为200μg/mL的BSA原液。2)考马斯亮蓝G－250试剂的配制:在50mL 95%(V/V)的乙醇中加入100mg的考马斯亮蓝G－250，充分溶解后加入120mL的85%(W/V)磷酸，用蒸馏水定容到1 000mL。配制好的考马斯亮蓝G－250试剂转移至棕色瓶当中于常温下可保存1个月。

标准曲线测定:经测定0～200μg/mL BSA标准曲线如图1所示，得到回归方程:y=0.005x+0.017，R2=0.999 1。

图1 考马斯亮蓝法测定蛋白的标准曲线

样品测定:取出根据标准曲线的测定范围稀释的样品溶液1mL，取考马斯亮蓝G－250试剂5mL加入其中后充分进行震荡混合，经过2min染色后，在595nm波长测吸光度OD595值，并将其代入标准曲线求出样品相应的蛋白浓度。

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

按南京建成公司SOD试剂盒说明书来加入试剂。

试剂加入后，充分混匀，在室温下放置10min，用1cm光径比色杯于波长550nm处，用蒸馏水进行调零，进行OD值的测定。

备注:在预实验中通过抑制率计算公式等最终确定实验中所取的蒸馏水及样本量为0.001mL。

计算公式:

1.3.5 脂质过氧化物(MDA)含量测定

按南京建成公司MDA试剂盒说明书来加入试剂。

通过漩涡混匀器将其混匀后，将试管口用保鲜膜扎紧，并用针头在上面捅一个小孔，置于95℃下水浴40min，取出后在流水下对其冷却。之后在4 000r/min转速下进行低速离心10min，取上清，用1cm光径比色杯在波长532nm处，用蒸馏水进行调零，测得各管的OD值。

通常情况下，每批当中应做标准管，标准空白管以及测定空白管1～2支，但由于在预实验当中发现测定管中的蛋白含量不是太高，因而测定空白管没有测定，而是由标准空白管进行替代。

肝组织中MDA含量计算公式:

2 结果与分析

通过1.3.4所示方法测定各组小鼠肝组织TSOD含量，结果如表1，图2中所示。

从表1中可看出，空白对照组中SOD含量最高，相较之下，其他经辐照处理组的SOD含量低很多(P＜0.01)。表明4.0Gy剂量的辐照能导致小鼠肝脏中SOD活性显著降低。

表1 各组肝组织SOD和MDA含量比较(s)

表1 各组肝组织SOD和MDA含量比较(s)

注:与辐照对照组相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 n SOD含量(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)6 462.56±10.14 6.85±0.27辐照对照组 6 294.31±7.28 10.27±0.56≧100ku多糖组 6 310.25±11.21* 10.31±0.37 30～100ku多糖组 6 321.74±5.24＊＊ 8.62±0.19＊＊≦30ku多糖组 6 363.93±6.10＊＊ 8.93±0.43空白对照组＊＊

图2 各组肝脏组织SOD含量比较柱形图

从图2可明显看到，相较于辐照组，各多糖给样组的T－SOD均有所升高，其中≧100ku多糖组有一定的提高(P＜0.05)，而30～100ku多糖组和≦30ku多糖组两组则有更为明显的提高(P＜0.01)，故而可知三种分子量段多糖对辐照降低SOD含量有一定的抑制作用，其中较小的两种分子量段多糖的这种抑制作用更为明显。

通过1.3.5所示方法测定各组小鼠肝组织MDA含量，结果如表1，图3中所示。

从表1中可看出，空白对照组中MDA含量最低，与之相比，其他各组经辐照后MDA含量均有明显上升(P＜0.01)。表明4.0Gy剂量的辐照能导致小鼠肝脏中MDA含量显著升高。由于MDA能使酶分子中氨基酸发生交联、肽链断裂，形成新的聚合物，从而产生新的大分子，使原来酶活性丧失或改变，破坏细胞的膜结构，使膜内外离子交换紊乱加速自由基的产生［7］，故而可推测4.0Gy剂量辐照对小鼠脏器细胞膜结构有不同程度的损害作用。

图3 各组肝组织MDA含量比较柱形图

从图3中各组的对比可看出，辐照可明显增加肝脏组织当中的MDA的含量。与辐照对照组比较，≧100ku多糖组的MDA含量并无明显变化，而30～100ku多糖组和≦30ku多糖组两组则出现了较为明显的减少(P＜0.01)。由此可知30～100ku和≦30ku两个分子量段的多糖对辐照提升MDA含量有较为明显的抑制作用。

3 讨论

随着科学水平的提高及核能技术在各领域的推广和发展普及，使得核能与人们平常的生活密不可分，正因为这样，人体受到放射线辐射伤害的机会也大大增加。前不久日本福岛核电站放射性物质泄露，对海面及周边领域造成了大面积的放射性污染，对周围地区和国家的居民造成了伤害，这在无形当中都促使着人们加大开展对抑制辐照危害的研究。辐射对机体造成损害，其间接作用于机体内水分子，可产生大量的自由基，对机体细胞和组织产生氧化伤害作用。

自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成丙二醛MDA等脂质过氧化物。MDA具有细胞毒性，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，对机体细胞造成损伤［8］。因此测定MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。超氧化物歧化酶(SOD)能清除掉超氧阴离子自由基(O－2·)，保护细胞使其免受损伤，故而其在机体的氧化与抗氧化的平衡当中起着至关重要的作用［9］。

通过对SOD活性和MDA含量测定的结果比照发现，30～100ku和≦30ku两个分子量段的多糖在小鼠辐照后均明显提升了其肝脏中SOD的活性并有效降低了其MDA的含量，显示这两个分子量段的多糖对肝脏有一定的辐射损伤保护作用。

本研究实验通过不同组小鼠肝脏组织SOD及MDA活性含量测定比较对不同分子量段孔石莼多糖致辐照引起的小鼠机体氧化损伤的抑制作用进行了初步研究。结果显示，在三种分子量段的孔石莼多糖组中，小鼠的SOD活性与辐照对照组的相比，三个多糖组均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，其中30～100ku和≦30ku两个分子量段多糖组均具有明显的差异(P＜0.01);小鼠的MDA活性与辐照对照组的相比，≧100ku分子量段多糖组无显著性差异，而30～100ku和≦30ku两个分子量段多糖组均具有明显的差异(P＜0.01)。说明低分子量段孔石莼多糖对辐照引起的小鼠肝脏的氧化伤害产生了明显的抑制作用。

从本次实验的结果，可以初步得出这样的结论:低分子量段孔石莼多糖对小鼠肝脏组织的氧化损伤具有一定的保护功能，可作为临床上应用辐照进行肿瘤理疗及其他高辐射环境下作业时的辅助用药，对于降低辐照致动物肝脏组织损伤具有重要的意义。但是，全面评价孔石莼多糖抑制辐照的肝脏组织氧化损伤作用，揭示其抗诱变作用的物质基础和机理，以及单一分子量段孔石莼多糖抗辐射抗氧化的量效关系还需要进一步的深入研究。

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