常亚青封妮莎王轶南丁君刘志敏穆小虎

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023)

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

常亚青,封妮莎,王轶南,丁君,刘志敏,穆小虎

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023)

强壮弧菌Vibriofortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotusintermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1× 103、4.1×102cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。

虾夷马粪海胆;强壮弧菌;PCR检测;gyrB基因

虾夷马粪海胆Strongylocentrotusintermedius于1989年由大连海洋大学自日本引进中国,目前已经成为中国主要的海水养殖品种之一。随着海胆养殖业的发展及养殖环境的污染,海胆也面临着病害的威胁,如海胆的黑嘴病、红斑病、秃海胆病等细菌性疾病及海胆变形虫病等[1-4]。……