舒成仁，卫乐乐，葛苗苗（1.湖北黄石市中心医院药剂科，湖北黄石435000；.华中科技大学附属协和医院药剂科，武汉 4300）

阿折地平是一种新型二氢啶类钙通道阻滞药，它能扩张血管，降低外周血管和冠脉血管阻力，增加冠状窦血流，改善心脏和肺的血液流动力学。对轻症或中等症状原发性高血压、肾障碍伴高血压以及重症高血压患者的降压作用较好。笔者通过测定健康志愿者口服阿折地平片后的血药浓度，观察其经时变化过程，估算药动学参数，为临床用药提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-MS/MS系统，包括API-4000型三重四极杆串联质谱仪（美国Applied Biosystem Sciex公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪，包括Analyst 1.5.1数据处理系统（美国Agilent公司）；AUW2200精密天平（日本Shimadzu公司）；BR16型高速冷冻离心机（河北白洋离心机厂）；XW-80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

1.2 试药

阿折地平片（江苏云阳集团药业有限公司，规格：每片8 mg，批号：20100120）；阿折地平对照品（江苏云阳集团药业有限公司，批号：20090316，纯度：99.6%）；内标：哌罗匹隆对照品（山东中科泰斗化学有限公司，批号：090801，纯度：99.57%）；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵为色谱纯。

2 方法

2.1 色谱和质谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（50 mm×2.1 mm，4.6 μm）、Phenomenex Security GuardTMC18预柱；流动相：甲醇-10 mmol·L－1醋酸铵缓冲液（含1%甲酸）＝70∶30；流速：0.8 mL·min－1；进样量：10 μL。

采用电喷雾（ESI）-多离子反应监测（MRM）进行离子方式监测，离子监控条件：气帘气：25.00 psi；GAS1：60.0 psi；GAS2：60.0 psi；喷雾电压：5 500 V；去溶剂浓度：500 ℃；Ihe：ON；碰撞气（CAD）：6.00；射入电压（EP）：10.00 V。阿折地平和内标哌罗匹隆的解簇电压（DP）分别为80 V和150 V；碰撞能量（CE）分别为：36.8 eV和50 eV；用于检测的离子反应分别为m/z583.5→m/z167.2（阿折地平）和m/z427.5→m/z177.0（哌罗匹隆）。

2.2 受试者选择

健康志愿者24名（男、女各半），受试者平均年龄为（23.75±2.02）岁，平均身高为（167.5±8.45）cm，平均体质量为（59±7.6）kg。在研究开始前7天内，每人接受1次全面体检，合格者参加本试验。受试前2周及试验期间，不服用任何其他药物。经医学伦理委员会审批通过，本人签署知情同意书。

2.3 分组与给药方案

单剂量给药：健康受试者24名，配对比较法随机分组，即按性别、体重加以配对，随机分为A组和B组，每组12人（男、女各半），A组受试者口服阿折地平片8 mg，B组口服16 mg。多剂量给药：阿折地平片，每日8 mg，连续服7 d，每日07：30空腹用200 mL温开水送服。

2.4 血样采集

单剂量口服给药：分别给予8 mg和16 mg药物，并于给药前0 h及给药后0.5、1、2、3、4、6、9、12、24、36、48、72、96 h时收集血样。多剂量口服给药：8 mg单剂量给药结束后即入组多剂量给药试验。多剂量给药组每天服药1次，每次8 mg，连续给药7 d。于给药后的第3、4、5、6天清晨服药前采血，第7天服药前及服药后0.5、1、2、3、4、6、9、12、24、36、48、72、96 h时收集血样。于－70℃避光保存。

2.5 血样处理

避光精密吸取血浆200 μL至2 mL离心管中，加入内标（100 μg·L－1哌罗匹隆）溶液50 μL，混匀，加乙腈600 μL沉淀蛋白，涡旋混匀1 min，于15 000 r·min－1、4 ℃离心5 min，取上清液10 μL进样测定，记录色谱图及化合物的峰面积，采用内标法进行定量。

2.6 方法学考察评价

2.6.1 特异性考察：取空白血浆样品、空白血浆加待测物、受试者血浆样品，将以上样品按照“2.5”项方法处理并测定，色谱图见图1。结果显示，阿折地平和内标哌罗匹隆的保留时间分别为1.4 min和0.7 min左右；干扰峰的峰面积小于最低定量限峰面积的20%，不影响测定的准确度。

2.6.2 标准曲线的绘制及最低定量限：精密吸取人空白血浆180 μL，移至2 mL塑料离心管中，分别避光加入阿折地平系列标准溶液20 μL，配成含阿折地平7种不同浓度的标准含药血浆样品，按“2.5”项方法处理并测定，记录色谱图。以阿折地平与内标的峰面积之比（Y）以及加入浓度（X），进行线性拟合，权重系数为1/Y2，求得的直线回归方程：Y＝0.704 3X+0.012 23（r＝0.998 4），结果表明，阿折地平血药浓度在0.05～40.00 μg·L－1范围内线线性关系良好。阿折地平在血浆中的最低定量限为0.05 μg·L－1。

2.6.3 回收率与精密度考察：阿折地平高、中、低3种质量浓度（0.1、4、30 μg·L－1）的日内 RSD 分别为 3.263%、3.308%、2.735%，日间RSD分别为8.365%、7.273%、4.840%，提取回收率在101.41%～102.17%之间，相对回收率在94.63%～97.24%之间，符合生物样品分析要求。

2.6.4 介质效应考察：阿折地平3种不同浓度质控样品的介质效应分别为94.90%、97.69%、101.68%，内标的介质效应为102.66%。在5种不同来源的空白血浆中介质效应基本恒定在85%～115%范围之间。

2.6.5 稳定性考察：阿折地平不同浓度的标准含药血浆样本（每个浓度做3份样本，长期稳定性5份），按”2.5”项所述方法处理并测定，考察血浆样本于不同保存条件下的稳定性。考察结果显示，处理后的样本于自动进样器4℃避光放置4 h、室温下避光放置4 h、反复冻融3次和－70℃避光保存56 d的情况下稳定。

图1 典型图谱A.空白血浆；B.空白血浆+0.05 μg·L－1阿折地平对照品溶液+25 μg·L－1内标溶液；C.健康受试者1号口服阿折地平8 mg后4 h的血浆样品+25 μg·L－1内标溶液；Ⅰ.阿折地平；Ⅱ.哌罗匹隆Fig 1 Typical spectrumA.blank plasma；B.blank plasma+azelnidipine control（0.05 μg·L－1）+internal standard（25 μg·L－1）；C.plasma sample obtained from a healthy volunteer at 4 h after oral administration of azelnidipine 8 mg+internal standard（25 μg·L－1）；Ⅰ.azelnidipine；Ⅱ.perospirone

2.7 数据处理

采用非房室模型计算受试者给药后的药动学参数。用SPSS 15.0软件包进行方差分析（ANOVA），显著性差异的标准为P＜0.05。单剂量给药2个剂量组间及与多剂量给药组间药动学参数的比较：AUC0～96h、AUC0～∞、cmax经剂量校正后采用方差分析；tmax、t1/2直接采用方差分析。

3 结果

3.1 单剂量与多剂量口服阿折地平片的药动学参数

单剂量给药后各剂量组多数受试者符合二室模型，药动学参数按照二室模型拟合，各主要药动学参数详见表1（表中，＊表示单剂量组间比较；#表示多剂量组（8 mg）与单剂量组（8 mg）比较）；单剂量给药后阿折地平的平均药-时曲线详见图2；单剂量和多剂量口服阿折地平片停药后平均药-时曲线见图3。

3.2 单剂量和多剂量口服阿折地平片后男、女药动学参数

单剂量和多剂量口服阿折地平片后男、女药动学参数比较见表2。

4 讨论

阿折地平遇光易发生光歧化反应，故所有操作都应在遮光条件下进行。本试验建立的阿折地平液-质联用（LC-MS）法，样品提取操作较简便、灵敏度高、样品稳定性及回收率等均符合生物样本测定要求、专属性强，适合阿折地平药动学及生物等效性研究[1，2]。

2组12名健康受试者分别单剂量口服给药8、16 mg后所得的药动学以非房室模型计算药动学参数，经统计学检验，t1/2、AUC0～96h、cmax、AUC0～∞经剂量校正后各组间差异均无统计学意义，说明在8～16 mg剂量范围内本品基本呈线性药动学特征。试验过程中受试者在生命体征、自主症状、生化指标等方面未见异常，表明阿折地平在此剂量范围内，在中国健康受试者中具有良好的耐受性。

多剂量口服给药后所得的药动学以非房室模型计算，与等剂量单次给药动学参数比较，除t1/2、CLz/F外，其他参数均无显著性差别，说明本品每天给药1次的给药方法在中国人体内几无蓄积作用。健康受试者的药动学行为及药-时曲线与国外文献报道的同种产品基本一致[3]。

本试验结果表明，各组主要药动学参数在受试者的性别方面表现为单剂量口服低剂量组除Vz/F外，其余参数均有显著性差别（P＜0.05）；单剂量口服16 mg组t1/2以及多剂量口服8 mg组t1/2、cmax存在显著性差别，其他参数无显著性差别。阿折地平单剂量给药低剂量组男、女存在一定差异，高剂量及多剂量给药组基本不存在显著性差异。

表1 单剂量和多剂量口服阿折地平片后的药动学参数（n＝12）Tab 1Pharmacokinetic parameters of azelnidipine after single and multi-oral oral dose ofAzelnidipine tablet（n＝12）

图2 单剂量给药后阿折地平的平均药-时曲线Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of azelnidipine after single oral dose

图3 单剂量和多剂量口服阿折地平片停药后平均药-时曲线Fig 3 Mean plasma concentration-time curve of azelnidipine after stopping taking single and multiple oral dose

表2 单剂量和多剂量口服阿折地平片后男、女药动学参数比较（n＝6）Tab 2 Comparison of pharmacokinetic parameters of azelnidipine between male and female after single and multiple oral dose ofAzelnidipine tablet（n＝6）

[1]Li D，Li L，Peng CM.Determination of azelnidipine in human plasma by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，43（2）：575.

[2]Kuramoto K，Ichikawa S，Hirai A，et al.Azenidipine and amlodipine：a comparison of their pharmacokinetics and effects on ambulatory blood pressure[J].Hypertens Res，2003，26（3）：201.

[3]Kiyoshi K，Yoko U.Simultaneous determination of azelnidipine and two metabolites in human plasma using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2006，844（1）：45.