郭雷静，李鑫，张淑芹，陆思静#（.辽宁医学院，辽宁锦州00；.辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 00）

不动杆菌是常见的革兰阴性杆菌之一，为重要的条件致病菌。近年来不动杆菌临床标本分离率和耐药率逐渐升高，其中最受关注的是鲍曼不动杆菌。2009年CHINET[1]数据显示，鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗生素特别是头孢菌素类耐药率均超过50%，分离率占革兰阴性杆菌第4位；而北京协和医院[2]鲍曼不动杆菌则超过铜绿假单胞菌上升到第2位，仅次于大肠埃希菌，对头孢菌素类耐药率均超过70%。我院2010年共检测出鲍曼不动杆菌62株，其中多重耐药鲍曼不动杆菌（MDRAB）为38株，占61.29%。目前国内、外多项研究表明，产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）机制是细菌对头孢菌素类抗生素耐药最重要的原因之一。为了解我院MDRAB携带耐药基因状况，笔者对38株MDRAB进行了超广谱酶基因检测，为探讨细菌耐药机制及指导临床合理应用抗生素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2010年辽宁医学院附属第一医院住院患者临床标本不动杆菌共62株，筛选出MDRAB共38株，剔除同一患者相同部位重复分离株。38株MDRAB中，痰液17份，导管痰10份，分泌物3份，胸水、尿液及脓液各2份，血液、脑脊液各1份。

1.2 主要试剂与仪器

MicroScan WalkAway 40全自动微生物鉴定系统及其配套的鉴定药敏复合板（美国Dade公司生产）；100 bp ladder DNA marker、琼脂糖纯化试剂盒、dNTP及Taq DNA聚合酶均为大连TaKaRa公司产品；多重聚合酶链反应（PCR）引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司生产；DNA Thermal Cycler 2400为美国Perkin Elmer公司产品。

1.3 药敏试验方法

采用微量稀释法测定细菌对抗菌药物的敏感性，根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2007年版要求进行抗生素敏感性判断，用WHONET 5.4软件分析结果。抗菌药物品种分别为头孢吡肟（FEP）、头孢曲松（CRO）、头孢噻肟（CTX）、头孢他啶（CAZ）、氨苄西林/舒巴坦（SAM）、哌拉西林（PIP）、替卡西林/克拉维酸（TCC）、复方磺胺甲唑（SXT）、环丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LVX）、亚胺培南（IPM）、庆大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）、阿米卡星（KAN）。标准质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC 25922。

1.4 超广谱酶基因的PCR检测及DNA测序分析

从LB培养基上挑取单个受试菌落加入5 mL LB培养液中，37 ℃、200 r·min－1震荡孵育16～20 h。取1.5 mL菌液12 000 r·min－1离心5 min，弃去上清，加入80 μL蒸馏水混匀，95 ℃加热10 min后12 000 r·min－1离心5 min，取上清2 μL作ESBLs基因检测的模板。

引物序列出处及反应条件见表1。

表1 PCR引物序列和产物长度Tab 1 Sequence of PCR primer and the length of products

PCR扩增体系均为25 μL，每个体系中包含：（1）10×loading buffer 2.5 μL；（2）20μmol·L－1的引物各 0.5 μL；（3）1.25 U的 TaqDNA 聚合酶；（4）模板 2 μL；（5）浓度为 10 μmol·L－1dNTP各 0.5 μL，最后加灭菌去离子水至25 μL。

在紫外灯下观察扩增PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳中的分析结果，出现明亮目的条带者为阳性。阳性条带行切胶纯化后送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，登陆GenBank用Blast程序分析、比对。

2 结果

2.1 科室分布

MDRAB在重症监护室（ICU）检出率最高，其次为呼吸科和神经外科，感染部位以呼吸道和手术切口为最高，分别为67.5%和17.5%。该菌在不同科室的分布见表2。

表2 38株MDRAB分布株数和百分率Tab 2 Number and percentage of 38 strains of multidrug resistantA.baumannii

图1 TEM基因PCR结果电泳图M.100 bp ladder DNAmarker；N.阴性对照；1～6.WSW01～06Fig 1 Electrophoretogram of PCR product of TEMM.100 bp ladder DNAmarker；N.negative control；1～6.WSW01～06

图2 PER-1基因和SHV基因PCR电泳图M.100 bp ladder DNAmarker；1.WSW30；2～6.WSW32，35～38Fig 2 Electrophoretogram of PCR product of PER-1 and SHVM.100 bp ladder DNAmarker；1.WSW30；2～6.WSW32，35～38

2.2 对14种抗生素耐药性

38株MDRAB对14种抗生素的耐药结果及超广谱酶基因检测结果见表3。

2.3 耐药基因阳性结果及测序后结果

38株MDRAB中TEM基因阳性33株（86.84%，图1为部分结果），PER-1基因阳性5株（13.16%）、SHV基因阳性1株（2.63%）（见图2）。其中，5株TEM、PER-1基因均阳性，占13.16%；1株TEM、SHV基因均阳性，占2.63%。取TEM、PER-1和SHV基因所有阳性产物纯化并送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，结果和GenBank上报道的已知序列相比对，证实为TEM、PER-1和SHV，同源性均为99%。

3 讨论

我院分离的38株MDRAB占所有不动杆菌（62株）的61.29%，高于2009年[1]CHINET细菌检测数据的44%。我院的ICU为综合ICU，同时收住呼吸、神经外科和骨创外科等危重症病人，好转后再转到相应科室，加上包括呼吸机在内的有创性治疗措施的广泛应用，此为MDRAB的传播和流行提供了很好的机会。因此，加强医院管理，积极有效地控制鲍曼不动杆菌感染和传播是极其重要的。

本研究显示，38株菌全部符合多重耐药不动杆菌（对以下3种或3种以上抗生素耐药：头孢菌素类、碳青霉烯类、含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类及氨基糖苷类抗生素）标准。由表3可见，对阿米卡星敏感率为15.79%（6株），耐药率为84.21%（32株）；对妥布霉素敏感率为13.16%（5株），耐药率86.84%（33株）；对头孢他啶、替卡西林/克拉维酸耐药率均为92.11%（35株），仅7.89%（3株）对头孢他啶敏感，但对替卡西林/克拉维酸为中介（7.89%），无敏感菌株。对其余9种抗生素包括头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟耐药率均为100%，无敏感菌株。其中的30株菌对14种抗生素全部耐药，导致几乎无药可选。而且相对敏感的氨基糖苷类抗生素因副作用及短期内极易产生耐药性限制了其在临床的长期、广泛应用。对于感染MDRAB的患者，其治疗费用及死亡率势必增加，预后极差。

本研究中38株MDRAB中33株均产生TEM型β-内酰胺酶。近年来国内在鲍曼不动杆菌中已经检测到了TEM、CTX、SHV、PER-1、VEB、GES等基因，但仍以TEM和PER-1检出率最高。TEM是革兰阴性杆菌中最常见耐药基因，可使细菌对青霉素和第3、4代头孢菌素以及单环类抗生素耐药，但对头霉素及碳青霉烯类抗生素敏感。PER-1在鲍曼不动杆菌中检出的报道日益增多，其既可为质粒编码又可为染色体编码，在上游存在插入序列ISPa12，此序列可能与提高其表达有关[6]。PER-1可以水解广谱头孢菌素、头孢哌酮/舒巴坦及氨苄西林/舒巴坦，但不水解或较弱水解亚胺培南和美罗培南。此外，PER-1还可以导致对氨基糖苷类抗生素的耐药，如庆大霉素及阿米卡星，因此也更有力地表明了多重耐药的存在。国外也有大量PER-1的报道，特别是在韩国、土耳其非常流行，也见于法国、比利时和玻利维亚[7，8]。国内也有多家医院报道了PER-1基因的存在；PER-2在阿根廷、美国也有报道。本研究中发现了1株携带SHV基因的耐药菌株，在我国北京、广州、福州等[9]地区也发现了SHV的鲍曼不动杆菌。虽然SHV基因不是我院的鲍曼不动杆菌多重耐药最主要的原因，但也要引起警惕。发现5株同时携带TEM和PER-1基因，1株同时携带TEM和SHV，应密切观察和监控这样的危险菌株，防止其在院内暴发和流行。

本研究中有5株MDRAB的PCR扩增产物均为阴性，一方面是由于未对所有的耐药基因进行检测；另一方面细菌耐药机制除产超广谱酶基因酶以外，还同时存在着产其他β-内酰胺酶如Ampc酶、青霉素结合蛋白亲和力下降、外膜孔蛋白（OprD）缺失及主动外排泵等其他的耐药机制。目前认为，整合子不仅可以介导细菌耐药性聚集导致多重耐药产生，而且可以在不同遗传物质和菌株间转移，这些将有待于进一步研究。

表3 38株MDRAB药物耐药性及超广谱酶基因检测结果Tab 3 Drug resistance and extented-specturm β-lactamase genes of 38 strains of multidrug resistantA.baumannii

[1]张小江，徐英春，俞云松，等.2009年中国CHINET鲍曼不动杆菌细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2010，10（6）：441.

[2]王 贺，张小江，刘文静，等.2009年北京协和医院细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2011，11（3）：161.

[3]Jones CH，Tuckman M，Keeney D，et al.Characterization and sequence analysis of extended-spectrumβ-lactamaseencoding genes from Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，and Proteus mirabilis isolates collected during tigecycline phase 3 clinical trials[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53（2）：465.

[4]Lim KT，Yasin R，Yeo CC，et al.Characterization of multidrug resistant ESBL-producing Escherichia coli isolates from hospitals in Malaysis[J].J Biomed Biotechnol，2009：ID165637.

[5]陈童恩，许小敏，刘 鹏，等.ICU泛耐药鲍曼不动杆菌分离株相关耐药基因检测[J].现代实用医学，2009，21（1）：47.

[6]Pasteran F，Rapoport M，Petroni A，et al.Emergence of PER-2 and VEB-1a in Acinetobacter baumannii strains in the Americas[J].Antimicrob Agents Chemother，2006，50（9）：3 222.

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[8]Naas T ，Bogaerts P，Bauraing C，et al.Emergence of PER and VEB extended-spectrum beta-lactamases in Acinetobacter baumannii in Belgium[J].J Antimicrob Chemother，2006，58（1）：178.