周国庆 唐 琴 杨明峰 黄 丽 孙保亮

(山东省高校脑微循环重点实验室，泰山医学院附属医院神经内科，山东泰安 271000)

CD4+CD25+调节性T细胞是一组具有免疫抑制功能的T细胞亚群，此亚群为某些组成性表达CD25(IL-2受体α链)的CD4+T细胞。其可以分为天然调节性T细胞(natural Treg，nTreg)和获得性调节性T细胞(adaptive Treg，aTreg)，nTreg主要指胸腺髓质T细胞发育成熟后进入外周的Treg细胞，在预防病理性自身免疫反应中发挥作用;aTreg是由感染、移植、癌症等抗原诱导CD4+T细胞转化形成，在感染和移植免疫等发挥重要作用［1］。由于CD4+CD25+调节性T细胞约占正常人或大小鼠外周血CD4+T细胞的5% ～10%，由于其数量少，极大限制了其在多种疾病中的临床应用。本实验通过近年发展较快的免疫磁性分选技术，应用免疫磁珠两步法分离纯化大鼠脾脏和淋巴结CD4+CD25+调节性T细胞，并对其进行流式检测和细胞活性检测。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，由山东中医药大学动物中心提供，体重275～300 g。

1.2 实验试剂和仪器

大鼠CD4+CD25+调节性T细胞提取试剂盒、MagCellect磁性分离仪购于 R＆D公司;Anti-rat CD4(APC)、Anti-rat CD25(PE)购于eBioscience公司;HANK＇S培养液购于Solarbio公司;FACS溶血素购于BD Biosciences公司;流式细胞仪购于美国BD公司;立式压力蒸汽灭菌器购于上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠脾脏和淋巴结细胞悬液制备

将大鼠麻醉过量处死，无菌取脾脏和淋巴结(头颈部，腋窝，腹股沟等部位)，放入已高压消毒的无菌培养皿中，加入10 ml HANK＇S培养液;将其用磨砂玻璃片研磨，过100目滤网过滤转至15ml的离心管中;1100 r/min离心5 min，去上清后加入5 ml FACS溶血素，混匀后静置5 min;加入10 ml的PBS，1100 r/min离心8 min;去上清，加15 ml HANK＇S培养液离心洗涤一次，弃上清，用1×MagCellect Buffer将其悬浮，调整细胞悬液浓度至1×108/ml。……