孙弘宇，于 涛，于 平

(中国石油大庆炼化公司，黑龙江 大庆 163411)

根据有关生物代谢途径，由于烷烃在水中的溶解度很小，菌体如何摄取到足够量的烷烃是影响菌体生物转化烷烃生产壬二酸的关键。烷烃被菌体吸收后，菌体代谢烷烃的核心是α、β、ω氧化，要提高壬二酸的产量必须促进α、ω氧化，抑制β氧化。作者在此研究了生物法生产壬二酸的过程中吐温-80、乙酸钠、丙烯酸、苯巴比妥等小分子效应物对壬二酸产率的影响。

1 实验

1.1 出发菌种

热带假丝酵母。

1.2 方法

1.2．1 吐温-80对壬二酸产率的影响

在配制发酵培养基时，加入不同量的吐温-80，发酵结束后补水至原体积，通过测定发酵液中壬二酸的含量来研究吐温-80对壬二酸产率的影响。

1.2.2 乙酸钠对壬二酸产率的影响

在配制发酵培养基时，加入不同量的乙酸钠，发酵24 h，测定菌液OD值；继续发酵，发酵结束后补水至原体积，通过测定发酵液中壬二酸的含量来研究乙酸钠对壬二酸产率的影响。

1.2.3 丙烯酸对壬二酸产率的影响

将丙烯酸稀释10倍，单独灭菌。发酵24 h时，将不同量丙烯酸加入到发酵培养基中；继续发酵，发酵结束后补水至原体积，通过测定发酵液中壬二酸的含量来研究丙烯酸对壬二酸产率的影响。

1.2.4 苯巴比妥对壬二酸产率的影响

在配制发酵培养基时，加入不同量的苯巴比妥，发酵结束后补水至原体积，通过测定发酵液中壬二酸的含量来研究苯巴比妥对壬二酸产率的影响。以不加苯巴比妥、且种子培养时未加入烷烃为对照组。

分别在种子培养开始时、发酵开始时、发酵12 h后加入0.2%苯巴比妥，通过测定发酵液中壬二酸的含量来确定苯巴比妥的最佳加入时间。

2 结果与讨论

2.1 吐温-80对壬二酸产率的影响

热带假丝酵母转化烷烃的第一步是将细胞外的烷烃转运到胞内，这一步是利用菌株对烷烃的亲和力和乳化能力来实现的。

本实验通过加入乳化剂吐温-80来考察菌体吸收烷烃的效果。吐温-80对壬二酸产率的影响见图1。

图1 吐温-80对壬二酸产率的影响

由图1可以看出，加入0.05%的吐温-80，壬二酸产率达到最高；随着吐温-80添加量的增大，反而不利于产酸，壬二酸产率下降。这可能是因为，吐温-80是菌体代谢的中间产物，加入少量的吐温-80，能促进烷烃和水的乳化，有利于菌体摄取烷烃，故能提高壬二酸的产率；但吐温-80添加量过多，抑制了作为中间产物的乳化剂的产生，导致菌体摄取烷烃量不足，反而不利于产酸。

2．2 乙酸钠对壬二酸产率的影响

乙酸基团与乙酰CoA有相似处，且可作为菌体的碳源，添加适量的乙酸钠有利于壬二酸的积累。乙酸钠对壬二酸生长和产率的影响见图2。

图2 乙酸钠对壬二酸生长和产率的影响

由图2可以看出，添加乙酸钠不仅能够促进菌体的生长而且有利于壬二酸产率的提高，但乙酸钠添加量超过1.5%后，壬二酸的产率反而下降。这说明，乙酸钠促进产酸是由于菌体量增加的缘故；当乙酸钠添加量超过1.5%后，由于高浓度的乙酸钠对菌体α、ω氧化有抑制作用，且抑制作用大于菌体量的增加，所以壬二酸产率反而下降。

2．3 丙烯酸对壬二酸产率的影响

据报道[1]，丙烯酸能抑制脂肪酸的β氧化。丙烯酸对壬二酸产率的影响见图3。

图3 丙烯酸对壬二酸产率的影响

由图3可以看出，将0.10%的丙烯酸加入到培养基中能使壬二酸产率提高20%左右。这可能是由于，丙烯酸的加入，有效地抑制了菌体的β氧化，从而降低菌体分解壬二酸的能力，有利于壬二酸的积累；但过高浓度的丙烯酸却抑制菌体的生长，使菌体的α、ω氧化也受到抑制，反而降低了壬二酸的产率。

2．4 苯巴比妥对壬二酸产率的影响

据报道[2]，烷烃能诱导细胞色素 P450完整的酶系，且P450酶的诱导量与烷烃浓度呈正相关。同时有研究发现，苯巴比妥也能明显诱导细胞色素 P450酶的生成[3]。苯巴比妥对壬二酸产率的影响见图4。

图4 苯巴比妥对壬二酸产率的影响

由图4a可以看出，加入苯巴比妥与加入烷烃的产率相近，说明苯巴比妥与烷烃一样能诱导细胞色素 P450酶的生成。当苯巴比妥的添加量为0.1%～0.3%时，壬二酸的产率较高(图4b)。

虽然加入的烷烃可以进一步被微生物转化为壬二酸，并对发酵液中提取精制纯品影响小，但从成本上考虑，苯巴比妥的最适添加量为0.2%(25 g苯巴比妥价格不超过10.0元)，而烷烃的最适添加量为5%，成本较高。因此，选择加入0.2%的苯巴比妥。

在不同时刻加入0.2%苯巴比妥的壬二酸产率见图5。

图5 苯巴比妥加入时刻对壬二酸产率的影响

由图5可以看出，在发酵开始时加入苯巴比妥，壬二酸的产率最高(达61.1 g·L-1)，说明此时的诱导效果最好。因此，选择发酵开始时加入苯巴比妥。

3 结论

发酵过程中小分子效应物对壬二酸产率的影响较大：添加少量吐温-80有利于菌体吸收和转化烷烃；乙酸钠、丙烯酸均能抑制菌体的β氧化；苯巴比妥与烷烃一样能诱导P450酶的产生，明显有利于壬二酸的生物转化，在发酵开始时添加0.2%的苯巴比妥效果最好，壬二酸的产率可达61.1 g·L-1。

参考文献：

[1] 刘树臣，李兰，方向晨.十三碳二元羧酸发酵技术的研究[J].微生物学报，2000，40(3)：318-322.

[2] 谭余庆，霍海如.苯巴比妥钠诱导细胞色素P450对内毒素所致鼠毒性的保护作用[J].中国药学杂志，2001，36(2)：97-100.

[3] 焦鹏，华玉涛，李书良，等.热带假丝酵母转化烷烃过程中P450酶活的研究[J].微生物学报，2001，41(1)：117-120.