张 楠，陈波水，方建华，王 九

(解放军后勤工程学院，重庆 401311)

石油及石油产品主要由烷烃和芳香烃等碳氢化合物组成，因其固有的生态毒性和难生物降解性而给环境带来严重的危害[1，2]，石油烃污染环境的原位修复和异位修复一直是研究热点[3～7]。生物修复通过添加营养物质和(或)微生物提高污染物在环境中的生物降解能力[8，9]，是治理烃污染的有效方法。石油烃的生物降解过程和降解程度受温度、pH值和微生物营养物质(如某些含N、P的化合物)等因素的影响[10～14]。深入研究石油烃的生物降解过程和机制、了解烃降解菌的生理生化特性，是实现烃污染环境生物修复的重要基础。

作者在此以正十六烷(以下简称C16)为唯一碳源，通过富集培养从石油污染土壤中分离出1株C16降解菌，在对菌株进行鉴定的基础上，考察不同pH值条件下菌株对C16的降解能力，以期为石油烃污染的生物修复提供帮助。

1 实验

1.1 土壤样本

重庆某油库储油罐附近土壤(砂土和沙壤土)。

1.2 主要培养基

无机盐培养基：NaCl 0.1 g，NH4NO30.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.01 g，CaCl20.05 g，用NaH2PO4-NaOH调节pH=5.0或用KH2PO4-K2HPO4调节pH=6.0、7.0、7.8，蒸馏水定容至100 mL，于121 ℃蒸汽灭菌30 min。

C16富集培养基：1.0 g C16加入100 mL无机盐培养基中。

C16无机盐培养基：0.2 g C16加入100 mL无机盐培养基中。

1.3 C16降解菌的分离与鉴定

1.3.1 菌株的分离

采用富集法对C16降解菌进行分离、纯化。方法如下：土壤样本经破碎、过筛、除杂、混匀后，称取50 g加入250 mL无菌水中，充分振荡，浸泡并曝气24 h；取适量接种于100 mL C16富集培养基中驯化，在37 ℃、160 r·min-1下振荡培养，10 d为1个驯化周期，经3个驯化周期后，取富集培养液在LB平板上分离、纯化；据含甘油培养物保藏法于-70 ℃保存备用。

将纯菌种接种于LB液体培养基，于32 ℃、200 r·min-1下振荡培养12 h，8500 r·min-1离心10 min，去上清，称菌体湿重，用无机盐培养基配成10%(质量分数，下同)的菌悬液，备用。

1.3.2 菌株的鉴定

菌株的形态观察方法参见文献[15]。采用VITEK32型全自动微生物分析仪进行自动化鉴定。

1.4 C16降解菌的降解特性测定

1.4.1 标准曲线的绘制

准确称取C16(分析纯)0.0520 g、0.1011 g、0.1523 g、0.2024 g、0.2491 g，分别置于10 mL容量瓶中，用正己烷(分析纯)定容并混匀。采用气相色谱[GC900气相色谱仪：FID检测器；OV17毛细管气相色谱柱；载气(高纯N2)流速50 mL·min-1；燃烧气(H2)流速50 mL·min-1；空气流速100 mL·min-1；检测器温度220 ℃；进样器温度280 ℃；柱温220 ℃；进样量0.5 μL]测定C16的色谱峰面积，采用外标法对峰面积(y)和C16质量(x)进行回归并绘制标准曲线。

1.4.2 降解特性研究

在pH值为7.0的100 mL C16无机盐培养基中加入10%的菌悬液0.5 mL，于34 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养一定时间后，依次加入15 g NaCl、10 mL正己烷和100 μL 6 mol·L-1的HCl，于32 ℃、200 r·min-1摇床振荡20 min，然后将培养液倒入分液漏斗静置、分层，取上层清液置于25 mL消解管，加入1 g无水Na2SO4，摇匀，放入4 ℃冰箱中静置1 d，采用气相色谱测定C16峰面积，根据标准曲线计算C16质量，依下式计算C16降解率ε：

式中：m为C16降解后的质量，g；m0为C16降解前的质量，g。

1.4.3 pH值对菌株降解能力的影响

分别在pH值为5.0、6.0、7.0、7.8的100 mL C16无机盐培养基中加入10%的菌悬液0.5 mL，于34 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养5 d，采用气相色谱测定峰面积，计算C16降解率。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

从土壤样本中分离出1株以C16为唯一碳源的菌株。该菌株在LB平板上的生长情况以及经革兰氏染色后的形态见图1。

图1 菌株的形态

由图1可知，所分离的菌株在LB平板上的生长菌落为中等大小，不规则形，中间凸起，表面湿润，透明，边缘不整齐，平板呈浅绿色，革兰氏染色阴性；在油镜下呈卵圆形或短杆状。

菌株全自动微生物分析鉴定结果见表1。

表1 菌株自动化鉴定结果

注：“-”表示反应结果为阴性；“+”表示反应结果为阳性

由图1和表1初步确定菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

2.2 C16的标准曲线(图2)

图2 C16的标准曲线

由图2可知，拟合的C16回归方程为：y=4942620x-5984,R2=0.9933。表明C16的质量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 菌株对C16的降解作用

接种微生物的培养液中C16降解率随降解时间的变化见图3。

图3 C16降解率随降解时间的变化

由图3可知，C16降解率随降解时间的延长而升高，尤其是第3 d后降解率升幅更为明显，到第6 d时降解率达97.3%。表明所分离的菌株具有良好的降解C16的能力，是有效的C16降解菌。

2.4 pH值对菌株降解能力的影响

不同pH值条件下，接种微生物的培养液培养5 d后的C16降解率见图4。

图4 C16降解率随pH值的变化

由图4可知，在弱酸性至弱碱性(pH值6.0～7.8)条件下，C16能较好地被铜绿假单胞菌所降解；不同pH值下的降解率大小依次为pH值7.0>pH值6.0>pH值7.8>pH值5.0，即中性条件(pH值7.0)最适宜C16降解。在较强酸性条件(pH值5.0)下，菌株降解C16的能力较差，可能是酸性条件下菌株代谢途径改变的缘故。

3 结论

经过富集培养、分离，获得1株以C16为唯一碳源的菌株。根据形态观察和自动化分析鉴定，初步确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。气相色谱分析结果表明，所分离的铜绿假单胞菌菌株具有良好的降解C16的能力，且在中性条件下的降解能力最强。

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