张 林，侯艳红，张 健，胡 静，张 静

1.解放军第309医院消化内科，北京100091;2.解放军第四军医大学分子生物学教研室

近年来随着肿瘤治疗技术的不断进步，分子靶向药物的出现和大规模运用于临床已成为人类肿瘤治疗上新的希望。目前进入临床治疗胃癌的主要是EGRR单克隆抗体类药物，在实际对胃癌患者的在治疗中表现出一定的效果。双特异性抗体(BsAb)是一种人工合成的具有同时识别并结合两种无关抗原的单个抗体分子。利用双功能抗体的桥接作用将体内的T淋巴细胞等效应细胞募集到肿瘤组织周围起到良好的抑瘤作用，目前已有部分研究报道［1-2］。本研究旨在通过初步的化学合成抗EGFR/抗CD3双功能抗体，并通过体外实验初步验证抗EGFR/抗CD3双功能抗体对胃癌细胞的杀伤能力。

1 材料与方法

1.1 材料 胃腺癌细胞系SGC7901为解放军总医院老年消化病实验室保存，抗人EGFR单克隆抗体、抗人CD3单克隆抗体均购自美国Abcam公司，N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸盐(SPDP)、二硫基苏糖醇(DTT)及MTT均购自美国Sigma公司。普通细胞培养板、培养瓶购自比利时 Orange公司，ThemoLabsystems酶标仪(美国Thermo Electron公司)，倒置相差显微镜及荧光显微镜均购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 抗EGFR/抗CD3双功能抗体(BsAb)制备:采用化学耦连法按Chen等［3］步骤进行，抗人EGFR单抗和CD3单抗各取1 mg/mL分别在中性PBS缓冲液中于4℃透析10 h。取SPDP乙醇溶液，按8∶1比例分别加入抗人EGFR单抗和抗CD3单抗于透析袋中混匀，室温反应30 min，将抗人EGFR单抗以0.1 mol/L pH 4.5的醋酸盐缓冲液透析，抗CD3单抗则以0.1 mol/L pH 7.5的PBS透析，每2.5 h换透析液1次，共换3次。取等体积经处理的抗人EGFR单抗和抗CD3单抗，混合后加入适量DTT至终浓度50 mmol/L，室温摇匀30 min，4℃下以PBS透析10 h，中间换透析液4次。8 000 r/min离心10 min，取上清，紫外分光光度计下测量蛋白浓度，25 μm滤膜除菌备用，SDS-PAGE法检测抗体化学偶联合成的效果。

1.2.2 双功能抗体与SGC7901细胞及效应细胞(人PBLS细胞)的结合活性:采用活细胞间接免疫荧光法检测，以FITC标记的CD3分子标记检测抗EGFR/抗CD3双功能抗体与SGC7901细胞结合，以FITC标记的EGFR分子标记检测与人PBLS细胞的结合，并在荧光显微镜下观察，计数10个高倍视野计算平均阳性细胞率即为平均结合率。

1.2.3 EGFR/CD3 BsAb 介导 PBLS 细胞对 SGC7901细胞杀伤率检测:采用MTT比色法［4］，将靶细胞接种于96孔板中，每孔约1×104个细胞，培养24 h后，设置单靶细胞和单效应细胞对照组，其余按下述实验分组加入不同组分，每组设置5个重复对照，其中PBLS细胞按效靶比80∶1加入。A组:EGFR/CD3 BsAb(20 μg/mL)+PBLS细胞(2×105/mL)+SGC7901(2×105/mL);B 组:CD3 McAb(20 μg/mL)+PBLS细胞(2×105/mL)+SGC7901(2×105/mL);C组:EGFR McAb(20 μg/mL)+PBLS细胞(2 ×105/mL)+SGC7901(2× 105/mL);D 组:CD3 McAb(10 μg/mL)+EGFR McAb(10 μg/mL)+SGC7901 细胞(2 ×105/mL)+PBLS细胞(2×105/mL);E组:PBLS细胞(2×105/mL)+SGC7901(2×105/mL)，细胞培养24 h后，每孔各加入30 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h，吸去上清后每孔加入DMSO 100 μL并振摇30 min，用酶标仪测定，检测波长为590 nm。按公式计算出杀伤率。

1.2.4 EGFR/CD3 BsAb介导PBLS细胞在不同效靶比下杀伤率检测:MTT法检测，实验方法与上一步相同，只检测EGFR/CD3 BsAb介导PBLS细胞，按PBLS细胞与靶细胞的不同效靶比分为:40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1 共 8 组，每组设置 5 个重复对照。

1.3 统计学处理 使用SPSS 11.0统计软件，利用双因素及单一因素方差分析等方法进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白电泳结果 显示制备的EGFR/CD3 BsAb分子量大小约为两单克隆抗体分子量之和，无其他杂带出现，表明分离较纯(见图1)。

图1 蛋白电泳结果显示制备的EGFR/CD3 BsAb分子量大小约为43 KDFig 1 The result of SDS-PAGE showed that the relative molecular mass of EGFR/CD3 BsAb was about 43 KD

2.2 间接细胞免疫荧光法测定 双功能抗体与SGC7901及 PBLS细胞的结合率分别为82.6%和74.4%，表明双功能抗体与瘤细胞效应细胞的结合能力较强(见图2)。

图2 间接细胞免疫荧光法测定双功能抗体与SGC7901及PBLS细胞的结合率结果 A:双功能抗体与SGC7901细胞结合;B:双功能抗体与PBLS细胞结合;C:空白对照组检测结果Fig 2 The results of the cellular immumofluorescence detection A:The results of EGFR/CD3 BsAb’s binding to SGC7901 cells;B:The results of EGFR/CD3 BsAb’s binding to PBLS cells;C:The results of blank control group

2.3 细胞杀伤率比较 A组EGFR/CD3 BsAb介导PBLS细胞对胃癌细胞株SGC7901杀伤率为52.4% ±5.8%，显著高于其余各对照组(P＜0.05)，C组和 D组又略高于其他两组，但差异无统计学意义，其余组之间无显著差异，具体结果见图3。

2.4 EGFR/CD3 BsAb介导PBLS细胞在不同效靶比下的杀伤率 EGFR/CD3 BsAb介导PBLS细胞在不同效靶比下杀伤率有明显不同，在低于70∶1～80∶1时随着效靶比增加杀伤率显著提高，但在80∶1后曲线平缓，表明杀伤作用提升不明显，具体结果见图4。

图3 各组抗体介导效应细胞对SGC7901细胞的杀伤率Fig 3 The cell lysis rates of PBLS cells retargeted by BsAb against SGC7901 cells in all groups

图4 EGFR/CD3 BsAb介导PBLS细胞在不同效靶比下杀伤率Fig 4 The cell lysis rates of PBLS cells mediated by EGFR/CD3 BsAb against SGC7901 cells on different E∶T

3 讨论

目前针对各类恶性肿瘤的分子靶向治疗已经广泛应用于临床，成为继传统化疗、放疗之后内科治疗肿瘤的又一有力武器。对于以胃癌为代表的胃肠道肿瘤主要的分子靶向药物是以表皮生长因子受体(EGFR)为靶标的单抗和化学小分子抑制物。EGFR是C-erbB-1基因的表达产物，广泛分布于各组织［5-6］。EGFR介导的信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。研究表明［7］在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。近年来靶向EGFR药物已成为肿瘤治疗的新热点。在已投入临床实际应用中的靶向药物中以EGFR为靶点的单克隆抗体或化学抑制剂最为成熟。其中以ABX-EGF、IMC-C225(cetuximab)［8］、MAB528、MAB225［9］为代表的单抗类药物和以吉非替尼、erlotinib等为代表的小分子酪氨酸激酶抑制剂已经为肿瘤的治疗提供了新的希望。Cetuximab在结肠癌的治疗中已经成为重要的二线药物，在胃癌的治疗中也显示了良好的疗效。

但是单纯的单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂可能缺少免疫细胞配合难以充分发挥杀伤肿瘤的作用，治疗作用有限。本项研究旨在通过相对简单的方法合成EGFR/CD3双功能抗体，这样理论上既可起到原单抗的抗瘤作用同时可介导体内免疫效应细胞对EGFR表达阳性的胃癌细胞结合及杀伤。本项研究结果提示EGFR/CD3 BsAb在体外条件下介导免疫效应细胞对胃癌细胞的杀伤作用显著强于单克隆抗体。这一结果说明至少在体外条件下EGFR/CD3 BsAb确实起到了桥接效应细胞与肿瘤细胞的作用，为效应细胞的杀伤提供了有力的帮助。目前国内有少数研究者［10］采取类似方法合成了部分双功能抗体，并取得了一定的实验成果。国外类似研究开展的也较少，其中部分［11-12］以CD3单抗为基础合成双功能抗体并引导免疫效应细胞攻击乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞的研究结果提示此类双功能抗体能够强有力地提高抗瘤效果，但是对于胃癌的类似研究国外未见报道。结合这些研究结果，我们的实验结果提示EGFR/CD3 BsAb双功能抗体治疗胃癌可能具有重要的临床应用前景。

但是本项研究中存在着双功能抗体制备技术落后的问题，目前化学偶联合成只是最初的方法，用这种方法合成的双功能抗体分子量大，抗原性可能较强这些均影响了其潜在的临床使用。下一步我们将尝试双杂交瘤技术和基因工程技术制备分子量更小、更高效的双功能抗体以便更接近于临床应用。在实验中由于时间和经费的原因只进行了体外细胞学实验。在下一步研究中我们将进行体内动物模型实验，进一步在胃癌的模型动物上验证该双功能抗体的抗肿瘤功效。我们相信随着单克隆抗体类分子靶向药物的广泛应用，其不足之处也会逐渐体现，作为单抗药物的发展与补充，双功能抗体将最终广泛应用于临床，为进展期肿瘤患者提供新的治疗选择。

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