1株苯并[a]芘高效降解菌的分离鉴定

2012-07-19弓玉红郭凯凯

山西农业科学 2012年5期

弓玉红，郝林，郭凯凯

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

苯并[a]芘（BaP）是一种含5个环的稠环芳烃，它是由1个苯环和1个芘分子结合而成的多环芳烃类化合物[1]。其分子式为C20H12，分子量为252。在室温下，其为黄色或淡黄色晶体，熔点179℃，沸点496℃，相对密度为1.35，易溶于丙酮、二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷乙醇、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、乙醚等有机溶剂，极不易溶于水，这也是其在环境中难以被降解的原因之一[2]。苯并[a]芘大多是石油、煤炭等化石燃料以及木材、天然气、汽油、重油、有机高分子化合物、纸张、作物秸秆、烟草等含碳氢化合物的物质经过不完全燃烧而生成。苯并[a]芘则是一种强致癌物[3]，其不仅存在于石油产品中，而且也存在于食品、大气和煤焦油中[4]，也容易残留在土壤中。许多国家都进行过土壤中BaP含量调查，残留浓度取决于污染源的性质与距离[5]，公路两旁的土壤中BaP含量为2.0 mg/kg，在炼油厂附近土壤中为200 mg/kg；被煤焦油、沥青污染的土壤中，其含量高达650 mg/kg。农作物中的BaP残留浓度取决于生产地附近是否有工业区或交通要道[6]。许多国家的动物试验证明，苯并[a]芘具有致癌、致畸、致突变的特点。苯并[a]芘遇明火、高热可燃，受高热分解会释放出有毒的气体，即一氧化碳、二氧化碳、成分未知的黑色烟雾。

本研究在山西太谷县焦化厂周边耕地中采集被苯并[a]芘污染的土壤样品，分离筛选到1株苯并[a]芘降解能力较强的细菌，经初步鉴定，属于假单胞菌属，为土壤苯并[a]芘污染的生物修复提供依据，以及为降解土壤苯并[a]芘污染微生物多样性提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

土样采自山西省太谷县焦化厂周边耕地耕层土壤。富集用培养基[7]1 L：（NH4）2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，苯并[a]芘 5 mg（溶解于丙酮后加入），加水至1 L，pH值为7.5。2216E培养基1 L：蛋白胨5 g，酵母浸膏1 g，磷酸高铁 0.01 g，pH值为7.6～7.8。

1.2 苯并[a]芘降解菌分离方法

称取10 g土样加入到含有适量玻璃珠的100 mL无菌水中，振荡3 h[8-9]。静置30 min后，移取5 mL上清液到45 mL含有苯并[a]芘质量浓度为5 mg/L的无机盐培养基中，25℃，150 r/min摇床避光培养。每隔7 d移取10 mL菌液至灭菌的90 mL无机盐-苯并[a]芘液体培养基中进行富集培养；连续富集培养28 d后，移取混合菌液稀释，涂布于2216E固体平板培养基上分离、纯化，观察单菌落形态，并采用试管斜面保存菌株[10]，观察菌株并进行形态特征和生理生化特征鉴定。

1.3 降解菌的鉴定

1.3.1 分离菌株生理生化特征的检测生理生化特征检测参照文献[11]进行。

1.3.2 16 S rDNA测序的PCR扩增及系统发育树的构建菌株总DNA的提取：采用CTAB法提取细菌的DNA于TE缓冲液中，-20℃保存备用。PCR反应：采用细菌的16 SrRNA通用引物，以提取的总DNA为模板，对该菌株的16 S rRNA进行PCR扩增。反应体系为：模板DNA 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物和下游引物（20 μmol/L）各 1 μL，加无菌水至50μL。反应程序：95℃5min；94℃1min，53℃1 min，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃延伸10 min。然后对PCR扩增产物进行纯化，纯化产物送上海生工公司测序。所得测序结果在NCBI中进行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的几种菌株作为参比菌株，用MEGA软件构建系统发育树。

1.3.3 苯并[a]芘含量的测定在无机盐液体培养基中加入丙酮-苯并[a]芘母液，使苯并[a]芘的质量浓度达到5 mg/L。振荡培养10 d，同时设不接菌对照，每个处理重复3次。苯并[a]芘含量采用萃取-紫外分光光度法[11]测定。培养后向试管中加入环己烷重复萃取2次，合并萃取液在50mL容量瓶，定容，用紫外分光光度计在296 nm波长处测定其吸光度[1]，在标准曲线上对应查出样品中剩余的苯并[a]芘含量。

1.3.4 苯并[a]芘降解率的计算利用标准曲线计算样品中剩余苯并芘的含量，然后利用公式c＝（a-b）/a×100%计算降解率。

其中，c为降解率；a为空白样品中苯并[a]芘的含量；b为处理后剩余苯并[a]芘的含量。

2 结果与分析

2.1 苯并[a]芘降解菌的筛选与鉴定

以苯并[a]芘为唯一碳源筛选出1株高效降解菌，该菌株命名为A12，为球状，革兰氏染色呈阴性，极生鞭毛。根据文献[10]，对A12生理生化测定结果如表1，表2所示。其系统发育关系如图1所示。

表1 菌株形态鉴定结果

表2 菌株生理生化鉴定结果

菌株A12的16 S rRNA经测序后（NCBI序列号为AM184213.1），通过序列搜索和序列比对，发现菌株A12与Comamonas sp.DUT_AHX（DQ409079）的同源性最高，同源率为99.93%，Comamonas sp.DUT_AHX是1株睾丸酮丛毛单胞菌，对硝基苯有降解作用。与Pseudo-monas testosteroni属的其他菌株（M11224和AB127967）同源率均高于99%以上，而这些菌株对芳香族化合物均有降解作用。基于上述形态鉴定、生理生化鉴定和16 S rRNA序列分析结果，初步确定A12菌株为睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）。

2.2 苯并[a]芘降解率

苯并[a]芘降解标准曲线如图2所示。从图2可以看出，苯并[a]芘质量浓度在1.0～3.0 mg/L的范围内呈良好线性关系。对样品的吸光度值进行测定，得出其吸光度值为0.069，对照为0.135。用标准曲线y＝0.424 8x－0.101 6计算得出，空白样品中苯并[a]芘的含量（a）为0.557，处理后剩余苯并[a]芘的含量（b）为0.402。利用公式c＝（a－b）/a×100%计算降解率（c）为28%。综合得出，菌株A12在苯并[a]芘质量浓度为5 mg/L、转速为150 r/min、温度为28℃的条件下，振荡培养12 d，苯并[a]芘的降解率为28%。