张安红，罗晓丽，肖娟丽，王志安，吴家和

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.中国科学院微生物研究所，北京100101）

Btcry基因是从苏云金芽孢杆菌中分离的编码杀虫晶体蛋白ICPs的基因，是目前研究最为深入、应用范围最广的一类杀虫基因。这种杀虫蛋白对鳞翅目昆虫有毒杀活性。近20 a来，编码这种杀虫晶体蛋白的基因已经成功应用于植物基因工程，培育出多种转基因抗虫植物。其中，转基因抗虫棉花和抗虫玉米在生产上得到大规模的商业应用，取得了巨大的经济效益。虽然转基因作物的种植与应用有效地控制了害虫为害，但是，随着种植面积的不断扩大，尤其在没有采取庇护所等防范措施下，害虫对其产生抗性的几率也越来越大。目前，有很多报道指出，害虫对转基因作物产生了不同程度的抗性[1-2]。当前在中国，大面积种植转cry1A基因棉花，很好地控制了棉铃虫的危害，减少了农药的使用。正因为如此，造成了以前不是棉花主要害虫的大发生，如盲椿象、小菜蛾和粉纹夜蛾等。经过多年的种植，转Btcry1A基因棉花对棉铃虫的抗性有所下降[3-4]。因此，开发和利用其他类型的杀虫基因是当前十分迫切的要求。与ICPs相比，Vip是Bt营养期生长阶段分泌的蛋白，它不形成晶体，在氨基酸序列上与ICPs没有同源性，对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等多种农林害虫有杀虫活性，是一类新型的杀虫蛋白。Vips主要分为Vip1，Vip2和Vip3，在Vip3中已发现多个类型，其中，Vip3A蛋白是一种广谱杀虫蛋白，其对草地贪夜蛾（Spodoptra frugiperda）、甜菜夜蛾（Spoaoptera exigua）、烟蚜夜蛾（Heliothis virescens）等害虫有较高的毒杀作用[5]。因此，Vip3蛋白作为新的杀虫资源在研究和应用方面具有巨大的潜力。

1 Vip3的特性及其杀虫活性

Vip3和Cry毒素在Bt中产生的时间不一样，Vip3在Bt对数生长中期开始分泌，以可溶性蛋白形式分泌在培养基中，在Bt生长稳定前期到达高峰，而且在产孢期和产孢后期均保持高分泌量；而Cry在Bt生长稳定期开始分泌，在胞内形成晶体蛋白。Vip3和Cry毒素的物理特性也不一样，Vip3具有热不稳定性，在90℃处理20 min时失活；而Cry毒素具有较好的热稳定性[5]。

Vip3的杀虫谱和杀虫活性与ICPs不同。Vip3A对鳞翅目害虫具有广谱的杀虫活性，如对棉铃虫和甜菜夜蛾高毒，对秋黏虫的毒性比Cry1Ab和Cry1Fa高，对烟蚜夜蛾、小菜蛾也具有高杀虫活性[6-8]，杀虫活性均达纳克级水平。小地老虎对ICPs具有很强的抗性，但对Vip3A非常敏感；与Cry1A相比，Vip3A对小地老虎的毒性高出260多倍[5]，对粉纹夜蛾和烟蚜夜蛾也具有良好的杀虫活性[9-10]。

2 Vip3的作用机理

Vip3杀虫机理主要体现在毒素对昆虫中肠细胞的破坏。组织病理学表明，小地老虎饲喂含Vip3A饲料24 h后，昆虫的中肠上皮柱状细胞末端膨大成球状，杯状细胞在形态上有所改变，但没有受到明显的损伤；48 h后，上皮柱状细胞破裂，内腔充满降解的细胞碎片，杯状细胞受到明显的损伤，但这2种细胞仍然与基膜相连接；72 h后，中肠上皮层完全脱落，小地老虎死亡。

Vip3与已知的ICPs没有序列同源性和结构相似性。ICPs对昆虫的毒杀作用主要是在昆虫中肠的高pH条件下溶解杀虫的晶体毒素，经过一系列蛋白酶作用，C-端部分氨基酸首先被切除，N-端28个氨基酸随后也被切除，最终活性片段在cadherin类蛋白作用下形成聚合体，与中肠刷状缘膜囊上的特异性受体相结合，在细胞膜上产生离子通道，引起细胞膜穿孔，细胞破裂，造成昆虫生化代谢及生理功能失调，停止进食，最后死亡[11]。Vip3为可溶性蛋白，不需通过昆虫中肠的消化即可直接起作用，Vip3以可溶形式进入昆虫消化系统，到达中肠后经过一系列的蛋白酶作用，形成核心蛋白与中肠细胞结合，引起细胞膜穿孔，细胞破裂，造成昆虫生化代谢及生理功能失调，停止进食，最后死亡[12]。

3 转Vip3基因作物研究与应用

种植转基因抗虫作物是治理害虫的一个有效途径。目前，世界各地已有多个实验室构建了含有不同Vip3基因的转基因植物载体，并将其导入玉米、棉花和水稻等作物中[13]。Vip3新菌株、新杀虫特性、新杀虫蛋白及其编码基因的发现，为培育抗虫转基因植物提供了新的基因资源。

Estruch将培育出的转Vip3Aa基因抗虫玉米申请专利。他构建的T-DNA载体使用不同的启动子（全株表达的泛素启动子，在叶绿体中表达的PEPC启动子，在根际表达的MTL启动子）控制改造过的Vip3Aa基因（提高GC含量，使用玉米偏好密码子）在玉米中进行表达。结果表明，这些启动子控制下的转Vip3Aa基因玉米对于多种玉米害虫（如小地老虎、甜菜夜蛾、秋黏虫和粉纹夜蛾）均有杀虫活性[14]。先正达公司已成功地将Vip3A导入不同作物，得到高效抗虫多价转基因玉米、棉花，增加了转基因作物的抗虫谱，同时延缓了害虫的抗性发展。Syngenta公司将Vip3a20基因通过农杆菌介导转入棉花中获得的转基因棉花COT102进行注册，该转基因棉花对鳞翅目害虫如棉铃虫、烟蚜夜蛾、粉纹夜蛾、秋黏虫、甜菜夜蛾等均具有较高抗性[15]。而将Vip3a20转入玉米中获得的转基因玉米MIR162已进行了全面的评估，发现其对环境和人类健康均无影响[15]。同时，该公司还注册1种含有Vip3Aa和Cry1Ab基因的转基因棉花VipCot。这种棉花通过转Vip3A和Cry1Ab基因的棉花杂交获得。该棉花表达高剂量的杀虫毒素（转基因棉花表达的毒素至少是此毒素杀死敏感昆虫的25倍），对美洲棉铃虫和烟蚜夜蛾饲喂该棉花幼嫩叶片的试验显示，对2种害虫的杀虫率达到100%。人工接虫试验显示，超过20 000头的美洲棉铃虫或者烟蚜夜蛾被分别接种到转基因植株上，经过7 d，植株上的害虫只有几十头，经过14 d，害虫全部被杀死。试验结果表明，这种转基因抗虫棉对鳞翅目害虫的防治效果良好[15]。另外，印度国际基因工程和生物技术中心利用合成的Vips基因构建的转基因烟草和棉花也已在田间试验[16]。

浙江大学沈志成实验室（2006，中国专利，CN1818067A）构建了一个转基因植物T-DNA载体，载体组件为全株表达的泛素启动子和具有植物密码偏好的Vip3基因。此载体用基因枪或者农杆菌的方法转入植物愈伤组织中，使用愈伤组织进行生物测定。结果显示，转基因愈伤组织对稻纵卷叶螟、二化螟、玉米螟和秋黏虫有100%的杀虫活性。沈志成实验室还将Cry-Vip融合基因构建成转基因植物T-DNA载体转入水稻中，成功获得对二化螟和稻纵卷叶螟有抗性的转基因水稻[17-18]。从2005年开始，中国科学院微生物研究所与山西省农科院棉花研究所等单位合作，开始进行Vip3A的棉花转化与培育，现已通过农杆菌介导法获得120个转化后代，通过3 a的选育获得了Vip3A蛋白表达量高的纯合系，可望实现对棉花鳞翅目害虫广谱高抗的育种目标[19]。

4 展望

营养期杀虫蛋白Vip极大地丰富了Bt的杀虫毒素种类；由于营养期杀虫蛋白与晶体毒素蛋白的杀虫机理不同，而且营养期杀虫蛋白Vip与Cry杀虫晶体蛋白具有协同增效作用，所以，二者共同使用，不但能提高杀虫毒力，更重要的是能够有效地克服和延缓昆虫对Bt毒素抗药性的产生；这些特性将为人工构建特异高毒力工程菌和转基因抗虫植物提供新的思路和基因资源。随着新的cry基因不断涌现，必将为重要农业害虫的防治提供更多的选择，为Bt毒素杀虫机理和抗性机制的基础研究创造有利条件。

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