王绪英，左经会，林长松，向 红

(六盘水师范学院生命科学系，贵州六盘水 553004)

永思小檗(Berberis tsieniiYing)是小檗属植物，是贵州特有药用植物及贵州药用新资源，据报道永思小檗仅分布于盘县［1］，本研究发现其除分布于贵州西部的盘县(八大山)外，还分布于水城(纸厂)、钟山区(梅花山、韭菜坪)、威宁等地，生于山谷灌丛中，海拔高度为1800～2700m。其根和根皮入药，主治湿热痢疾，肠炎，黄疸，目赤红肿，咽痛［2］。其有效成分为盐酸小檗碱，广泛用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道、妇科及外科感染也有一定的疗效，近年来还发现它有抗心律失常的作用，服用后无明显副作用［3］。关于盐酸小檗碱的提取工艺在黄连、十大功劳、黄柏等作原料的研究较多，但由于黄柏等生长周期较慢，且药用部位局限性较大(只能用皮作为提取原料)，逐渐转向由三颗针做原料。通过实验我们发现在三颗针的有些种类中，可以用其根、茎或根皮、茎皮做原料，这样就扩大了用药部位。其主要生产方法有水煎煮、酸水提取、乙醇提取、酸醇提取等［4］，陈月圆等［5］以小檗碱为指标，对黄柏用水，乙醇，酸水3种提取溶剂提取发现乙醇作为提取溶剂明显优于其他溶剂。岑志芳等［6］研究发现超声提取可提高黄柏中盐酸小檗碱的提出率，缩短提取时间。同样条件下，与浸渍法提取比较提高近l倍。王志华等［7］以盐酸小檗碱的含量为指标，水提稍差于醇提;以浸膏得率为指标，醇提稍差于水提。乙醇和水都是极性溶剂，甲醇属强极性溶剂，可提取出其中的盐酸小檗碱，在甲醇中加入盐酸，能把药材中的小檗碱酸化为盐酸小檗碱，根据相似相溶原理而被提出［8］。

永思小檗仅分布于贵州西部，关于永思小檗的研究，国内仅见于其乙醇提取法的正交设计研究［9］，本研究以永思小檗为材料，盐酸小檗碱得率为指标，选择以水、乙醇、盐酸甲醇为提取溶剂，通过超声波提取，用正交试验设计考察超声时间，超声温度、超声体积等因素对盐酸小檗碱得率的影响，优选出永思小檗中盐酸小檗碱不同溶剂的最佳超声提取工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 盐酸小檗碱对照品由贵州迪大科技有限公司提供，永思小檗产于贵州省钟山区梅花山，实验前将永思小檗根加工成粗粉，50℃烘24 h，置干燥器备用。甲醇、乙醇、盐酸为国产分析纯，水为重蒸水。

1.1.2 试验仪器 JH－722型可见分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司)、METTER.AE240型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)、BGZ型电热鼓风干燥箱(上海博迅事业有限公司医疗设备厂)、HH－6型数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)、超声波提取仪(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)、DFT－200型高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

1.2 标准曲线的绘制

取置五氧化二磷真空干燥器干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品4.0 mg，用水溶解并移置100 mL容量瓶中定容，摇匀，即得浓度为40 μg/mL的盐酸小檗碱标准品储备液，备用。精密吸取盐酸小檗碱储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，同时蒸馏水作空白，分别测出吸光度(345 nm波长处有最大光吸收)，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3 样品含量的测定:

精密称取药材粉末，装入具塞三角烧瓶中，超声提取，合并滤液，浓缩，置100 mL容量瓶，加水定容，摇匀，即得供试液。分别精密吸取供试液1.0 mL，测定盐酸小檗碱含量，计算其得率。

1.4 正交试验设计

盐酸小檗碱由两个异喹啉环稠合而成［10］，微溶于冷水，易溶于沸水，几乎不溶于冷乙醇、氯仿和乙醚［11］，在热水或热乙醇中溶解度比较大［12］，由以上性质故选择以水，乙醇，盐酸甲醇作为提取溶剂进行正交实验。

1.4.1 乙醇的正交实验设计 首先选择对提取有影响的因素进行单因素实验，根据实验结果选择正交试验的因素，同时选择合适的水平，设计正交试验方案。根据影响乙醇提取的主要因素，选择乙醇浓度(A)、超声时间(B)、超生温度(C)、乙醇体积(D)作为考察因素，每个因素取3个水平(表1)。

表1 正交实验方案(乙醇)Table 1 The factor and level of orthogonal experiments(ethanol)

1.4.2 水的正交实验设计根据单因素实验结果，选择超声时间(A)、超生温度(B)、体积(C)作为考察因素，每个因素取3个水平(表2)。

1.4.3 盐酸甲醇的正交实验设计 根据对提取有影响的单因素实验结果，选择对选择超声时间(A)、超生温度(B)、体积(C)作为考察因素，每个因素取3个水平(表3)。

表2 正交实验方案(水)Table 2 The factor and level of orthogonal experiments(water)

表3 正交实验方案(盐酸甲醇)Table 3 The factor and level of orthogonal experiments(hydrochloric acid－methyl alcohol)

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线:按方法项下标准曲线的方法，用最小二乘法经线性回归，得盐酸小檗碱浓度C与吸光度A的回归方程:C=0.1031A+0.0033，r=0.9994。结果表明，盐酸小檗碱在 1.6 ～9.6μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

稳定性试验:取供试液室温放置 0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 后分别测定吸光度，相对标准偏差(RSD)为1.23%，说明供试液在24 h内基本保持不变。

精密度试验:分别精密吸取供试液1.0 mL，平行操作测定5次吸光度，结果RSD为1.62%。

2.2 正交试验

2.2.1 乙醇的正交实验结果 取永思小檗粗粉1 g，在平行操作下，按表1［L9(34)］进行正交实验，合并提取液浓缩至相同体积，备用。对结果进行统计学处理，结果见表4和表5:

从均值分析，A因素第一个水平是最优水平，因素B的第三个水平是最优水平，因素C的第三个水平是最优水平，因素D的第一个水平是最优水平。各因素的最佳水平A1B3C3D1，即45%乙醇以1:150的固液比，60℃下超声提取40 min。由极差分析，因素C的变化对盐酸小檗碱得率的影响最大，因素A次之，因素D的影响最小，即影响盐酸小檗碱得率的因素主次依次排序为提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。各个因素对盐酸小檗碱得率的影响都不显著。

表4 正交实验结果(乙醇)Table 4 The results of orthogonal experiments(ethanol)

盐酸小檗碱得率(mg)The content of berberine hydrochloride实验7 65% 20 60 1:因素Factor酒精浓度A(%)Concentration时间B(min)Time温度C(℃)Temperature固液比D Solid liquid ratio 200 10.3752实验 8 65% 30 40 1:250 9.7463实验 9 65% 40 50 1:150 10.8600均值 1 10.958 10.461 10.190 10.865均值 2 10.700 10.635 10.764 10.540均值 3 10.327 10.889 11.032 10.580极差0.631 0.428 0.842 0.325

表5 方差分析结果(乙醇)Table 5 Variance analysis result(ethanol)

2.2.2 水的正交实验结果 取永思小檗粗粉0.5 g，在平行操作下，按表2［L9(34)］进行正交实验，以盐酸小檗碱的得率为考察指标，合并提取液浓缩至相同体积，备用。对结果进行统计学处理，结果见表6和表7:

从均值分析，A因素第三个水平是最优水平，因素B的第三个水平是最优水平，因素C的第二个水平是最优水平。各因素的最佳水平为A3B3C2，即1:150的固液比，70℃下超声提取50 min。由极差分析，因素B的变化对盐酸小檗碱得率的影响最大，因素A次之，因素C的影响最小，即影响盐酸小檗碱得率的因素主次依次排序为提取温度＞提取时间＞水用量。各个因素对盐酸小檗碱得率的影响都不显著。

表7 方差分析结果(水)Table 7 Variance analysis result(water)

2.2.3 盐酸甲醇的正交实验结果 取永思小檗粗粉0.5 g，在平行操作下，按表3［L9(34)］正交实验，以盐酸小檗碱的得率为考察指标，合并提取液浓缩至相同体积，备用。对结果进行统计学处理，结果见表8和表9:

从均值分析，A因素第三个水平是最优水平，因素B的第一个水平是最优水平，因素C的第二个水平是最优水平。各因素的最佳水平为A3B1C2，即1:150的固液比，30℃下超声提取50 min。由极差分析，因素A的变化对盐酸小檗碱得率的影响最大，因素C次之，因素B的影响最小，即影响盐酸小檗碱得率的因素主次依次排序为提取时间＞盐酸甲醇用量＞提取温度。由方差分析，超声提取时间对盐酸小檗碱得率的影响显著。

表8 正交设计结果(盐酸甲醇)Table 8 The results of orthogonal experiments(hydrochloric acid－methyl alcohol)

表9 方差分析结果(盐酸甲醇)Table 9 Variance analysis result(hydrochloric acid－methyl alcohol)

2.3 最佳工艺验证实验

为考察乙醇、水、盐酸甲醇三种溶剂对永思小檗中盐酸小檗碱的优选提取工艺的稳定性，取永思小檗9份，每份0.5 g，按优选出的最佳工艺进行提取(三个平行)，测定盐酸小檗碱得率，结果见表10:

表10 盐酸小檗碱的提取率Table 10 The extraction rate of berberine hydrochloride

3 结论与讨论

1)永思小檗中盐酸小檗碱最佳超声提取工艺为:以150倍45%乙醇作溶媒，60℃超声，时间为40 min，影响盐酸小檗碱含量的因素主次依次排序为提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量;以150倍水作溶媒，70℃下超声提取50 min，影响盐酸小檗碱得率的因素主次依次排序为提取温度＞提取时间＞水用量，各个因素对盐酸小檗碱得率的影响都不显著;以150倍盐酸甲醇作溶媒，30℃下超声提取50 min，影响盐酸小檗碱得率的因素主次依次排序为提取时间＞盐酸甲醇用量＞提取温度。超声提取时间对盐酸小檗碱得率的影响显著。

2)从三种溶剂的最佳提取工艺可以看出，都是以150倍的固液比超声40或50 min，超声温度与溶剂沸点的大小相一致，溶剂的沸点越低，超声温度越低，分别为甲醇30℃，乙醇60℃，水70℃。从盐酸小檗碱的得率可知，水提取法最低，乙醇稍高，盐酸甲醇最高，这是由于盐酸小檗碱的极性比较强，根据相似相溶原理可以被提取出来，极性越高，越容易被提取出来。

3)从三种溶剂提取的盐酸小檗碱的得率来看，用盐酸甲醇作溶剂时盐酸小檗碱的得率最高，这与陈月圆等对黄柏用水，乙醇，酸水3种提取溶剂提取发现，乙醇作为提取溶剂明显优于其他溶剂的研究不一致，这可能与黄柏中含有大量的粘液质有关，也可能是用盐酸甲醇提取时有些极性大的杂质也溶解在溶剂中，造成结果偏高，这部分工作正在进行当中。

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