唐秀丽，付卫东 ，张国良，张衍雷，谭万忠

(1.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081;2.西南大学植物保护学院外来入侵生物研究中心，重庆北碚 400716)

黄顶菊Flaveria bidentis(L.)Kuntze是一种外来入侵植物。2001年首次在我国衡水湖发现，后相继出现在河北邢台、廊坊和天津等地，局部已经形成了黄顶菊种群［1－2］，对我国生态环境与农业生产造成了严重的危害［3－4］。黄顶菊是一年生草本，原产于南美洲［5－6］，属菊科(Asteraceae)堆心菊族(Helenieae)黄顶菊属(Flaveria)［3］。黄顶菊对农作物尤其是玉米田的危害尤为严重，在玉米整个生长期，黄顶菊均可危害［7］。国内外对黄顶菊的研究主要以生物学特性方面居多［4，8，9，10］。近年来，关于黄顶菊化感作用方面的研究也越来越多，植物化感作用是自然界普遍存在的一种现象，是植物生存的重要机制，也是外来植物入侵的一种重要机制［11，12］。已相继有黄顶菊水提液对绿豆种子［13］、小麦种子［14］、玉米种子［15］、油菜及油麦种子［16］等发芽指数方面［17，18］的报道。但是，关于黄顶菊对受体植物生理生化的影响报道少之又少，而对幼苗根尖的显微形态特征方面目前还没有报道。本试验以玉米为受体，探讨黄顶菊对玉米的化感效应，为揭示黄顶菊对农业生产的危害机制及抑制其蔓延有着重要意义，从而为综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄顶菊及其根际土壤采自河北省沧州市献县陌南村(E:115.62°，N:38.46°)，该地区是黄顶菊在河北的重度发生地，黄顶菊已经定植并且形成单一群落。

供试受体玉米(Maize L.，纪元1号)，购于中国农业科学院作物所。

1.2 试验方法

1.2.1 黄顶菊水提液制备取新鲜黄顶菊地上部分植株100 g，稍除枯枝黄叶后，整株用蒸馏水1000 mL于室温下浸泡36 h，后经4层定性滤纸抽滤得水提液，再将水提液用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，以此为母液(0.1 gDW/mL)，稀释成浓度为0.05 gDW/mL和0.01 gDW/mL，以供生物活性测定试验，后置入冰箱内4 ℃ 保存［19］。

1.2.2 玉米幼苗的准备 选取饱满度和大小基本一致的玉米种子，用0.5%H2O2处理5 min，后用蒸馏水反复清洗，置于恒温水浴锅内30℃催芽3 d(每天换新鲜水1次)。玉米幼苗培育采用沙培加营养液法，所以石英细沙于10%盐酸浸泡24 h后反复冲洗至pH 7.0左右，再用160℃烘干灭菌以供使用。营养液采用1/4强度Hoagland营养液［20］，PH调至5.8。在白瓷盆内播入已催芽且芽长基本一致的玉米种子，于生化培养箱中培养(培养条件12 h/12 h，30℃/25℃)，7 d后幼苗供试验使用。

表1 1/4强度Hoagland营养液配方Table 1 Prescription of the 1/4 strength Hoagland

1.2.3 对玉米幼苗的处理 将50 mL 三种不同浓度(0.1 gDW/mL、0.05 gDW/mL、0.01 gDW/mL)黄顶菊水提液中，分别加入50 mL1/4强度Hoagland营养液，后于振荡器上混匀3 min，移入培育后的玉米幼苗，每个白瓷盆中5株，置于温室中。无菌水为对照。分别处理后第4 d、第8 d、第12 d和第16 d取样，每个处理6个重复，整个试验共进行了三次重复。记录各盆中玉米株高，每盆随机选择玉米叶片0.5 g进行可溶性蛋白［21］、可溶性糖类［21］、脯氨酸［22］含量的测定。

1.2.4 幼苗根尖显微形态观察 选取最高浓度0.1 gDW/mL黄顶菊处理以及对照处理中玉米幼苗根尖生长点部位分别用生理盐水冲洗3次，每次5 min，再用3%戊二醛固定液24 h后，依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇系列脱水(每一梯度脱水20 min)，最后100%的乙醇脱水两次，后乙酸异戊酷置换，再用CO2临界点干燥，粘于铜片喷金度膜，最后再用扫描电镜(日立S－4800)下观察并照相［23－25］。

1.2.5 数据分析 采用Excel2003对数据进行处理，并采用SPSS16.0软件进行方差分析，组内多重比较采用Duncan’s新复极差法，计算值并作显著性检验，所有图标数据表示均为平均数±标准差(Means±S.D.)。

2 结果分析

2.1 黄顶菊水提液对玉米幼苗叶片可溶性蛋白的影响

不同浓度黄顶菊水提液处理玉米幼苗体内可溶性蛋白含量产生了一定的影响(图1)，方差分析结果表明不同浓度和不同处理时间后幼苗叶片的可溶性蛋白含量出现极显著性差异(F3，48=1365，P=0.0001;F3，48=460.913，P=0.0001)。且不同化感物质浓度和不同处理时间之间存在极显著的交互作用(F9，48=36.426，P=0.0001)，即不同浓度黄顶菊水提液对可溶性蛋白含量的影响随着处理时间的变化而异。自处理后第4 d开始，玉米幼苗叶片可溶性蛋白含量和对照中相比出现显著的活性差异，对照中可溶性蛋白含量由 1.14 μg/g·FW 增加到 5.58 μg/g·FW。两个高浓度(0.05 gDW/mL 和 0.1 gDW/mL)处理后，含量分别由 0.38 μg/g·FW 增加到 0.59 μg/g·FW，0.09 μg/g·FW 增加到 0.42 μg/g·FW。和对照相比增幅不大。组内多重比较表明，玉米幼苗叶片可溶性蛋白含量随着处理浓度增加而逐渐增加，随着处理时间的延长而逐渐减少。

图1 黄顶菊水提液对玉米幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Impacts of F.bidentis aqueous extracts on contents of soluble protein in leaves of maize seedlings

2.2 黄顶菊水提液对玉米幼苗叶片可溶性糖类的影响

不同浓度黄顶菊水提液处理对玉米幼苗体内可溶性糖含量产生了一定的影响(图2)，方差分析结果表明不同浓度和不同处理时间后幼苗叶片的可溶性糖含量出现极显著性差异(F3，48=30580，P=0.0001;F3，48=5415，P=0.0001)。且不同化感物质浓度和不同处理时间之间存在极显著的交互作用(F9，48=3296，P=0.0001)，即不同浓度黄顶菊水提液对可溶性糖含量的影响随着处理时间的变化而异。自处理第4 d开始，对照中可溶性糖类含量变化不大，由20.18 μmol/g变化为22.08 μmol/g，增幅仅为9.4%。最低浓度0.01 gDW/mL和最高浓度0.1 gDW/mL处理后，增幅分别达到45.9%和43.3%。组内多重比较表明，玉米幼苗叶片可溶性糖含量随着处理浓度增加和处理时间的延长而逐渐增加。

2.3 黄顶菊水提液对玉米幼苗脯氨酸含量的影响

不同浓度黄顶菊水提液处理后对玉米幼苗体内脯氨酸含量产生了一定的影响(图3)，方差分析结果表明不同浓度和不同处理时间后幼苗叶片的脯氨酸含量出现极显著性差异(F3，48=9119，P=0.0001;F3，48=518.916，P=0.0001)。且不同化感物质浓度和不同处理时间之间存在极显著的交互作用(F9，48=68.92，P=0.0001)，即不同浓度黄顶菊水提液对脯氨酸的影响随着处理时间的变化而异。两个最高浓度处理后第4 d到第12 d，脯氨酸含量分别增幅25.5%和37.0%，相对于对照中脯氨酸含量增幅9%，变化明显。组内多重比较表明，玉米幼苗叶片脯氨酸含量随着处理浓度增加和处理时间的延长而逐渐增加。

2.4 幼苗根尖显微结构

经最高浓度(0.1gDW/mL)黄顶菊水提液处理后，和对照相比，根尖表皮细发生了明显的变化。高浓度处理下表皮脱落细胞很多，根冠顶部细胞干瘪，部分脱落，尤其在顶部表层细胞，很多仅剩下空的细胞腔。内层细胞已经基本暴露出来，根冠顶部细胞大部分破裂。在×500倍的结果中可见，对照的根尖细胞排列规则且细胞成长圆形，形态明显，细胞比较扁平且饱满。被化感物质处理后，幼苗根尖细胞排列出现紊乱，明显膨胀，细胞内细胞质明显淡稀，空壳细胞。

3 结果与讨论

河北农大研究，黄顶菊对玉米胁迫时，可溶性蛋白含量减少［26］。生长在逆境环境中的植物其代谢反映变化趋势相同，即水解作用增强，合成作用减弱。由本研究结果可知，随着黄顶菊水浸提液质量浓度的增加，可溶性蛋白含量呈下降趋势，这可能是因为生长在含有黄顶菊环境中的玉米幼苗的生长受到抑制，其体内的水解作用增强，将可溶性蛋白降解为氨基酸。这种代谢失调最终产生植物的伤害作用。这与黄花蒿对小麦幼苗的化感作用一样［27］。

图4 黄顶菊水提液处理后玉米幼苗根尖细胞的变化Fig.4 Celluar changes of upland maize seedling roots treated with extracting liquor from F.bidentis

可溶性糖是植物体内主要的渗透调节物质之一，逆境胁迫条件下，作为植物渗透调节物质的可溶性糖含量的增加可以增加植物体内的渗透势，以利于植物体在逆境中维持体内正常的所需水分，提高植物的抗逆性［28］。实验表明黄顶菊植株水提液处理下玉米叶片中可溶性糖含量增加。可溶性糖含量的增加一方面能有效提高叶片细胞的渗透势，增强玉米幼苗对逆境胁迫的耐受性;另一方面，可溶性糖在玉米体内的积累，减少了糖类物质向其它物质的转变，从而阻碍了玉米幼苗的正常生长。类似与黄顶菊水提液对小麦幼苗的化感作用影响［29］，但是与芒其对玉米幼苗中可溶性糖类的影响有一些不同［30］。

脯氨酸(Pro)是植物在逆境胁迫下体内积累的重要渗透调节物质之一［31］。正常情况下，植物体内的Pro含量较低，胁迫时含量便会大大增高，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此Pro可作为植物抗逆性的一项生理生化指标［32］。通过本试验可知，不同浓度黄顶菊水提液胁迫下玉米幼苗，Pro含量差异均达极显著。且Pro含量随着黄顶菊水提液浓度的升高而升高，不同浓度处理时均比对照中脯氨酸含量要高。这与关于SO2对玉米幼苗中Pro影响趋势一样［33］。在黄顶菊水提液浓度为0.01 gDW/mL条件下，玉米幼苗叶片的脯氨酸含量的变化不大，说明玉米具有一定的耐受性。当浓度达到0.05 gDW/mL和0.1 gDW/mL条件下，脯氨酸含量急剧增加。而在后期，脯氨酸增加量幅度不大，处理中黄顶菊对玉米幼苗的抑制作用已经使得玉米不能正常生长。黄顶菊水提液处理下玉米叶片脯氨酸含量的增加有两种可能，一方面是黄顶菊水提液阻断了玉米幼苗根部游离氨基酸向蛋白质的转化，使游离脯氨酸含量增加;二是黄顶菊水提液能增加蛋白质的降解速度，加快游离脯氨酸的积累。这说明黄顶菊水提液对玉米的生长有较强的抑制作用，但黄顶菊水提液对游离脯氨酸含量增加的影响机制还需要进一步研究。

根系是作物直接感受外界水分信号并吸收水分的器官，与作物抗逆性形成密切相关。关于紫羊茅(Festuca rubra L.)对水芹(Oenanthe stolonifera(Roxb)Wall)和一种蟹草(Lygodium japonicum(T.)S.)的化感作用研究，发现其化感分泌部位在须根尖的局部细胞中［34］。黄顶菊水提液对玉米幼苗的化感作用，同样体现在对幼苗根长的生长状况上，类似于黄花蒿对小麦幼苗的影响［27］。根尖细胞的外观和解剖结果表明，玉米幼苗的根系生长和发育已严重受到抑制和干扰，主要表现在幼苗根尖细胞形态和大小的变化。应用扫描电镜研究紫茎泽兰水提液对玉米根的形态影响，结果显示处理后的玉米根尖生长受到严重干扰，根尖表皮出现明显脱落甚至腐烂，与本试验研究结果相一致［35］。

化感物质作为一种信息载体物质几乎存在于植物的所有器官中。对黄顶菊化感作用的研究，本实验选用受体植物内最直接明确的生理指标和形态指标，从而为后续探究黄顶菊化感作用机制奠定一定的基础。

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