梁 靓 王 菡 李毅然 张 琦

(陕西出入境检验检疫局 陕西西安 710068)

1 前言

小蠹虫属鞘翅目(Coleoptera)，小蠹科(Scolytidae)，是一类重要的林木害虫。由于幼虫的形态相似，很难分辨其种类。成虫虫体较小，也很难依据外部形态来鉴别，经常给检验检疫工作带来较大困难。因此，探索用同工酶电泳技术鉴定小蠹虫种类，对于口岸检疫工作具有非常重要的科学意义和经济价值。

同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有关系，而POD同工酶在动物和植物中都有存在，在植物细胞代谢过程中与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等也有一定的关系。目前同工酶电泳技术已成为研究昆虫的遗传变异、物种进化及种属鉴定的重要生化指标［1］。

2 材料与方法

2.1 材料

试验材料为海小蠹亚科的纵坑切梢小蠹(Blastophagus Piniperda Linnaeus)、齿小蠹亚科的十二齿小蠹(Ips sexdentatus Boerner)、云杉八齿小蠹(I.typographus Linnaeus)、重齿小蠹(I.duplicatus Sahalberg)、落叶松八齿小蠹(I.subelongatus Motschulsky)和中重齿小蠹(I.mannsfeldi Wachtl)以及小蠹亚科的桦边材小蠹(Scolytus ratzeburgi Janson)。7种小蠹虫均采自于内蒙古二连浩特口岸，虫体均活体采集保存于超低温冰箱中备用。

2.2 方法

将冷冻虫体(成虫切除鞘翅和腹部)用蒸馏水冲洗后吸干称重，按重量体积比(1：8)放入指形管加入缓冲液进行冰浴匀浆，将上清液作为电泳样品冷藏备用。采用电泳溶液配置法(PAGE法)，浓缩胶浓度为 2.5%，pH6.7;分离胶浓度为 7.5%，pH8.9;电极缓冲液为Tris－Gly，pH8.3。初始电流为10 mA，当前沿指示剂涌出浓缩胶面时，电流升至20 mA。电泳过程约5－6h。每个处理重复3次。电泳结束后取下凝胶进行染色［2］。

2.3 数据处理

相对迁移率(Rf值)计算方法如下：

x1为固定染色后酶蛋白区带的迁移距离;x2为固定染色前指示剂的迁移距离。

3 结果与分析

3.1 7种小蠹虫幼虫、成虫过氧化物酶同工酶酶带数比较

7种小蠹虫幼虫、成虫POD同工酶酶带数目、Rf值差异较大，幼虫和成虫共有酶带的Rf值均不相同，容易区分(见表1)。

表1 7种小蠹虫幼虫、成虫POD同工酶酶带数比较

3.2 7种小蠹虫幼虫和成虫过氧化物酶同工酶相似性比较

根据幼虫和成虫POD同工酶酶带Rf值的相似程度(表2)可以对比种的相似程度。

式中a：种A酶带数;b：种B酶带数;W：A、B两种相同的酶带数;C：相似性系数

重齿小蠹幼虫和中重齿小蠹无论幼虫还是成虫POD同工酶酶带Rf值相似程度都最大，相似性系数C均为67%。十二齿小蠹幼虫和重齿小蠹、中重齿小蠹幼虫POD同工酶酶带Rf值有较大的相似性。云杉八齿小蠹幼虫除与十二齿小蠹幼虫相似性系数C为40%外，与其他种小蠹虫相似性系数均为0。十二齿小蠹成虫和重齿小蠹、云杉八齿小蠹成虫POD同工酶酶带Rf值相似程度较大。重齿小蠹、中重齿小蠹成虫与桦边材小蠹、纵坑切梢小蠹成虫Rf值相似性系数均为0。落叶松八齿小蠹成虫与十二齿小蠹、重齿小蠹成虫、云杉八齿小蠹成虫Rf值相似性系数为0。云杉八齿小蠹成虫与桦边材小蠹、落叶松八齿小蠹成虫Rf值相似性系数为0。

表2 7种小蠹虫幼虫、成虫POD同工酶相似性系数C(%)

3.3 7种小蠹虫幼虫和成虫过氧化物酶同工酶聚类分析结果

聚类分析7种小蠹虫的幼虫和成虫(见图1、图2)。

图1 7种小蠹虫幼虫POD同工酶聚类图

图2 7种小蠹虫成虫POD同工酶聚类图

7种小蠹虫POD同工酶Rf值聚类分析结果表明，中重齿小蠹与重齿小蠹的幼虫之间和成虫之间聚类距离系数最小，表明它们之间的亲缘关系最近。5种齿小蠹在聚成一类后与纵坑切梢小蠹、桦边材小蠹再聚类，表明5种齿小蠹之间的亲缘关系最近，符合形态学分类结果。

4 讨论

7种小蠹虫POD同工酶电泳图谱表明酶带酶活性、数目及Rf值在种间差异明显。酶谱缺乏稳定性，重复性比较差。梁靓等［3］对7种小蠹虫EST同工酶进行比较，发现酶带数目比较多，并且幼虫酶带数目比成虫要多。而7种小蠹虫POD同工酶酶带数目较少。对7种小蠹虫POD同工酶Rf值相似性比较和聚类分析表明，中重齿小蠹与重齿小蠹的幼虫POD同工酶Rf值相似系数最大，成虫之间的相似系数也最大，聚类后距离系数都最小，所以它们的亲缘关系最近。5种齿小蠹聚成一类后才与桦边材小蠹、纵坑切梢小蠹聚类，表明5种齿小蠹的亲缘关系比其他小蠹虫近，符合形态学分类结果。

POD同工酶图谱中幼虫的酶带数目多于成虫，幼虫和成虫相同Rf值的酶带数目较少，有的幼虫或成虫未显示出酶带，所以没有充分体现出来种内的共性。以上结果表明，能否用POD同工酶电泳酶谱来鉴定不同种间的小蠹虫还有待于进一步研究探讨。

黄斑星天牛Anoplophora nobilis(Ganglbauer)和光肩星天牛A.glabripennis(Motschulsky)的外部形态很难区分，蒋京闽等［4］对它们的POD同工酶比较研究后，认为2个种是独立的种类，但他们之间的亲缘关系很近。唐桦等［5］对这2种天牛的EST同工酶进行比较，判定它们属于同一个种，将黄斑星天牛作为光肩星天牛的同物异名。POD同工酶在昆虫中的研究目前还较少，对POD同工酶在物种鉴别上的准确性还有待于继续研究。而大量EST同工酶的研究表明，不同种间的同工酶图谱清晰可见，在低级阶元(亚科以下水平)的分类中更具有鉴别性的意义。

［1］李鹤，施宗伟，沈佐锐.三种瘤背豆象幼虫酯酶同工酶的比较研究［J］.昆虫知识，2001，38(1)：62 －64.

［2］胡能书，万国贤.同工酶技术及其应用［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1985.

［3］梁靓，段立清，尹凤民，等.7种小蠹虫酯酶同工酶的比较研究［J］.植物保护，2007，33(6)：70 －74.

［4］蒋京闽，宋玉霞.两种天牛的过氧化物酶同工酶的比较研究［J］.昆虫知识，1988，25(5)：293 －294，297.

［5］唐桦，郑哲民.光肩星天牛与黄斑星天牛酯酶同工酶的比较研究［J］.北京林业大学学报，2002，24(1)：66 －68.