曹喜兵，赵改丽，范国强

(河南农业大学泡桐研究所，河南郑州450002)

DNA甲基化是真核细胞基因组主要的修饰方式之一，DNA甲基化特别是胞嘧啶甲基化具有表观遗传效应和突变效应，与基因表达调控、细胞分化、基因组印记、性染色体失活及细胞记忆等生物学过程密切相关［1～4］．检测 DNA甲基化的方法有高效液相色谱法、重亚硫酸盐法、甲基化特异性PCR、基因芯片法、质谱或色谱法以及甲基化敏感扩增多态性等方法［5］．其中，甲基化敏感扩增多态性( Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)是最常用的方法．该技术是在 AFLP技术基础上建立起来的，用甲基化敏感的同裂酶Hap II和Msp I代替AFLP高频内切酶Mse I．目前，该方法在毛竹(Phyllostachys heterocycla Var)、红豆杉(Taxus media)、杉木(Cunninghamia laneeolata(lamb．))、落叶松(Larix．leptolepis)、橡胶树(Hevea brasiliensis)［6～10］等研究中得到应用．泡桐(Paulownia spp．)是中国重要的速生用材和绿化树种之一，在改善生态环境和提高农民生活水平等方面起到重要作用，但丛枝病的发生严重影响了人们种植泡桐的积极性．研究表明，泡桐丛枝病的发生与DNA甲基化水平改变有关［11］，但目前国内外还未见有DNA甲基化模式变化与丛枝病发生相关的报道．本研究以豫杂一号泡桐为材料，建立了泡桐MSAP体系，并进行了引物筛选，以期为进一步阐明丛枝病发生与DNA甲基化的关系奠定基础．

1 材料与方法

1．1 试验材料

河南农业大学泡桐研究所林木生物技术实验室培养30 d的豫杂一号泡桐(Paulownia tomentosa×Paulownia fortunei)组织培养幼苗长约1 cm的顶芽．

1．2 试验方法

1．2．1 泡桐DNA提取 泡桐DNA的提取参照文献［12］．

1．2．2 泡桐MSAP双酶切体系优化 300 ng模板DNA，2．5 μL Buffer T，2．5 μL 0．1%BSA，16 U EcoR I，10 U HapⅡ，加离子水至25 μL．另1 种双酶切反应体系为300 ng 模板 DNA，2．5 μL Buffer T，2．5 μL 0．1%BSA，16 U EcoR I，10 U MspⅠ，加离子水至 25 μL．各体系混匀后于Biometra TGRADIENT PCR仪上进行37℃ 消化，80℃ 失活20 min，取5 μL在1%的琼脂糖凝胶上用高电场(4～5 V·cm－1)检测酶切效果．将酶切时间分为4，8，12 h的梯度，经1%琼脂糖电泳后，筛选出最佳酶切时间．

1．2．3 泡桐MSAP连接体系的优化 连接反应体系包括20 μL上述酶切产物以EcoR I/HapⅡ组合为标准(以下同)．0．16 μmol·L－1EcoR I接头，1．6 μmol·L－1H/M 接头，2．5 μL 10 × T4Buffer，T4连接酶 (5 U·μL－1)用量为2．0 U，加去离子水至25 μL．混匀后于PCR扩增仪上22℃连接，连接时间分6，8，18 h．

1．2．4 泡桐MSAP预扩增体系优化

1．2．4．1 连接产物用量的优化 在不同体系中分别加入5 μL稀释为1，10，20，50，100倍的连接产物，100 μmol· L－1dNTP，1 U Taq 酶，0．25 μmol·L－1E00，0．25 μmol·L－1H/M00，2 ．5 μL 10 ×PCR Buffer，用去离子水补至 20 μL．

1．2．4．2 dNTP浓度的优化 在不同体系中分别加入 dNTP 25，50，100，200 μmol·L－1，5 μL DNA( 连接产物稀释 5 倍 )，0．25 μmol·L－1E00，0．25 μmol·L－1H/M00，1U Taq 酶，2．5 μL 10 × PCR Buffer，用去离子水补至 20 μL．

1．2．4．3 引物浓度的优化 在不同体系中分别加入预扩增引物 E00 和 H/M00 0．15，0．25，0．35，0．5 μmol·L－1，5 μL DNA(连接产物稀释 5 倍)，100 μmol·L－1dNTP，1 U Taq 酶，2．5 μL 10 × PCR Buffer，用去离子水补至 20 μL．

1．2．4．4 Taq酶量的优化 在不同体系中分别加入 Taq 酶 (5 U·μL－1)0．25，0．5，1．0，2．0 U，其余为5 μL DNA(连接产物稀释 5倍 )，0．25 μmol· L－1E00，0．25 μmol· L－1H/M00，100 μmol·L－1dNTP，2．5 μL 10 × PCR Buffer，用去离子水补至20 μL．扩增程序为:94℃预变性 2 min，然后94℃，30 s;56℃，1 min;72℃，1 min;扩增29个循环，72℃，10 min;最后4℃保存．

1．2．5 泡桐MSAP选择性扩增体系优化

1．2．5．1 预扩增产物用量的优化 在不同体系中分别加入 5 μL 稀释1，20，30，80，150 倍预扩增产物，0．3 μmol·L－1EcoRⅠ，0．3 μmol·L－1H/M(E+AAA+H/M+AAA)，100 μmol·L－1dNTP，1．0 U Taq 酶，2．5 μL 10 × PCR Buffer，加去离子水至20 μL．

1．2．5．2 dNTP浓度的优化 在不同体系中分别加入 dNTP 25，50，100，200 μmol·L－1，稀释 20 倍预扩增产物 5 μL，0．3 μmol·L－1EcoR I，0．3 μmol·L－1H/M(E+AAA+H/M+AAA)，1．0 U Taq酶，2 ．5 μL 10 × PCR Buffer，加去离子水至20 μL．

1．2．5．3 引物浓度的优化 在不同体系中分别加入EcoRⅠ引物和H/M引物(E+AAA+H/M+AAA)0．05，0．2，0．3，0．4 ，0．5 μmol·L－1稀释 20倍预扩增产物 5 μL，100 μmol·L－1dNTP，1．0 U Taq 酶，2．5 μL 10 × PCR Buffer，加去离子水至20 μL．

1．2．5．4 Taq酶量的优化 在不同体系中分别加入 Taq 酶 0．25，0．5，1．0，2．0 U，稀释20 倍预扩增产物 5 μL，0．3 μmol·L－1EcoRⅠ，0．3 μmol·L－1H/M，100 μmol·L－1dNTP，2．5 μL 10 × PCR Buffer，加去离子水至20 μL．泡桐MSAP体系建立所用选择性扩增引物为(E+AAA+H/M+AAA)．

1．2．6 泡桐 MSAP引物筛选 以优化后的 MSAP体系，均采用3个选择性碱基合成的64×64对选择性引物进行筛选．取选择性扩增后样品5 μL在2% 琼脂糖上 (4～5 V·cm－1)电泳检测扩增效果．然后，将2．5 μL uffer加到装有试验效果较好的15 μL引物扩增产物的PCR管内混匀，95℃变性5 min后，取5 μL样品，用4% 变性聚丙烯酰胺凝胶，在60 W恒功率条件下电泳2 h，凝胶银染后扫描，选择谱带清晰和易计数的引物作为 MSAP反应的最佳引物．扩增程序为:94℃预变性 2 min，然后94℃，30 s;65℃，1 min(以后每循环降0．7℃ );72℃，1 min，扩增12个循环;94℃ ，30 s;54℃，30 s;72℃，1 min;扩增24个循环，72℃，10 min，最后4℃ 保存．

2 结果与分析

2．1 泡桐MSAP酶切反应体系优化

本试验在AFLP的基础上采用300 ng的模板DNA进行MSAP体系的优化，并对300 ng的模板DNA进行不同时间的酶切处理，经1% 琼脂糖电泳检测发现，经4，8，12 h酶切后，DNA片段都能被完全切开，并且几乎没差别(图1)，为保证MSAP试验顺利进行，故本研究采用8 h酶切．

图1 不同时间酶切DNA的琼脂糖凝胶电泳Fig．1 Agarose gel electrophoresis of DNA products

2．2 泡桐MSAP连接反应体系的优化

连接时间对泡桐MSAP连接体系的影响较大(图2)．连接的好坏直接关系到后续的扩增结果，在连接时间分别为6，8，18 h条件下，随着连接时间的延长，预扩增产物量逐渐增加．为试验操作方便，本体系选择连接反应时间为18 h．

图2 不同时间连接DNA的琼脂糖凝胶电泳Fig．2 Agarose gel electrophoresis of DNA products of different ligation time

2．3 泡桐MSAP预扩增体系的优化．

通过对预扩增反应的各因素优化发现，连接产物用量对预扩反应影响较大(图3)．当用连接产物原液进行扩增时，条带拖带严重，如果用原液进行扩增，浓度太大，影响后续试验，同时影响结果的准确性，随着稀释倍数增大，条带逐渐变弱，当连接产物稀释用量超过50倍时，泳带亮度较弱，为保证后续试验的顺利进行，泡桐MSAP预扩增体系中连接产物稀释10倍为宜．dNTP用量对预扩增反应有较大的影响(图 4)．当 dNTP 浓度为 25 μmol·L－1时，带型微弱，随着dNTP浓度增大，条带逐渐清晰，且扩增产物增多，当dNTP浓度为100 μmol·L－1时，预扩增产量较高，当 dNTP浓度大于100 μmol·L－1时，预扩增产物量减少，可能是因为dNTP与Taq酶竞争Mg2+，导致Taq酶活性下降，抑制PCR反应所致，在本试验设置的浓度范围内，选择100 μmol·L－1为预扩增体系中dNTP的适宜浓度．引物浓度对预扩增产物影响较大(图5)．当引物浓度为 0．3 μmol·L－1时，预扩增产物量较少，随着引物浓度的增大，扩增带型逐渐清晰，并在引物浓度达到 1 μmol·L－1时，产物最多，但有出现二聚体的趋势，为节省引物用量，选择引物浓度为 0．5 μmol·L－1为该体系的最佳引物浓度．

Taq酶量优化试验结果(图6)说明，Taq酶量对预扩增反应影响最大．当Taq酶量为0．25 U时，扩增产物量较少，当Taq酶量为0．5～1 U时，扩增产物带型清晰，但当Taq酶量增加到2 U时，扩增产物明显增多，但同时拖带现象比较严重，泳带不清晰．因此，从节约考虑，选择0．5 U作为泡桐MSAP预扩增体系中的最佳Taq酶用量．

图6 Taq酶量对预扩增的影响Fig．6 Effect of Taq enzyme dosage on preamplification

2．4 泡桐MSAP选择性扩增反应体系的优化

从优化的选择性扩增体系得出，预扩增产物用量对选择性扩增影响较大(图7)，300 ng DNA经酶切，连接和预扩后，预扩产物分别按1，20，30，80，150倍进行稀释，扩增产物在2% 琼脂糖凝胶上电泳检测发现，当用预扩增原液进行选择性扩增时，电泳结果主次分明的条带不明显，呈弥散状态，且拖带现象严重，随着稀释倍数的增大，泳道带型变化不大．为保证试验顺利进行，选择泡桐MSAP选扩增体系中预扩产物稀释30倍为宜．dNTP用量对于选择性扩增有较明显的影响(图8)．当dNTP 浓度 25 μmol·L－1时，dNTP 含量太少，并且形成二聚体，出现非特异性扩增产物，

图7 连接产物稀释倍数对选择性扩增的影响Fig．7 Effect of diluted multiple of ligation products on selective amplification

当 dNTP 为 100 μmol·L－1时，选择性扩增产物较多，泳带较亮，当浓度增加为 200 μmol·L－1时，预扩增产物拖带现象严重，不利于试验的正常进行．因此，将泡桐MSAP选择性扩增体系中dNTP的浓度设定为100 μmol·L－1．引物浓度对选择性扩增反应有较大的影响(图9)．当引物浓度为0．1 μmol·L－1时，扩增量较少，随着引物浓度得升高，扩增量随之增加，且带型逐渐清晰．因引物与模板比太高，易产生二聚体，因此，选取引物浓度为0．6 μmol·L－1．Taq酶量对于选择性扩增反应有较大的影响(图10)．当Taq酶为0．25 U时，泡桐MSAP没有扩增产物量，当Taq酶为0．5～1 U时，带型最好，但当Taq酶增加到2 U时，扩增产物量迅速增加．但拖尾严重，由于酶用量过多会产生高的错配率，导致特异性降低．因此，选择0．5 U为泡桐MSAP选择性扩增体系中Taq酶的最适用量．

图8 dNTP浓度对选择性扩增的影响Fig．8 Effect of different concentrations of dNTP on selective amplification

2．5 泡桐MSAP选择性扩增引物的筛选

按以上优化出的选择性扩增体系，根据最终4% 聚丙烯酰胺凝胶上条带所反映的清晰度，数目及重复性情况，从64×64对引物组合筛选出96对引物，序列如表1所示．其中前18对引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图11所示，筛选出的引物，电泳显示条带清晰，并且多态性丰富，可以用来进行 泡桐的DNA甲基化分析．

表1 泡桐MSAP选择性扩增引物Table 1 Primer for MSAP of the selective amplification

图11 18对引物的MSAP选择性扩增Fig．11 MSAP of selective amplification with 18 pairs of primers

3 结论与讨论

经过对MSAP各因素的优化，建立了适合泡桐分析的MSAP体系．25 μL酶切体系中，300 ng泡桐模板DNA经10 h双酶切效果最佳;经22℃连接18 h后，稀释10倍进行预扩增，为保证选择性扩增产物有足够的模板，预扩增产物稀释30倍进行选扩，在4% 聚丙烯酰胺凝胶上可以显示的多态性丰富、清晰度高、完整的带型．经引物筛选，从64×64对组合中筛选出适合泡桐分析的96对引物．

在优化体系的过程中发现，MSAP对DNA的质量要求比较高，提取的DNA在含有多糖、多酚和蛋白质的情况下，容易造成酶切失败，进而在聚丙烯酰胺胶上显示上端细小大片段带型较多，胶板上端背景加深，反之，高质量的DNA 300 ng即可获得效果较好的谱带．另外，不同组织器官提取的DNA选扩带型差异较大，这也体现在油菜种子萌发的研究中［13］．酶切后的连接是整个试验最关键的一步，连接成功是预扩的前提，若连接时间过短，会造成人工接头与酶切片段不能完全接上，过长不仅对连接效率没有太大提高，还对仪器损害较大，因此应适当延长连接时间，以保证接头顺利连接;dNTP浓度对试验结果有较大的影响，dNTP加入量过多，因dNTP与Taq酶竞争 Mg2+，导致 Taq酶活性下降，抑制PCR反应，反之容易出现非特异性条带，DNA聚合酶浓度对MSAP的扩增带型较敏感，随着酶的浓度增大，条带拖尾，容易造成带型显示失真，特异性降低，酶浓度较小，扩增不出条带．电泳时温度的高低对结果影响也较大，若电泳温度太高，胶板中下部分的泳带发散，温度太低，条带发虚模糊不清，电泳时温度维持在45～55℃之间最佳．染色时间对试验结果的影响较大，时间过长则会使胶板背景加深而影响观察，否则条带微弱、发散．因此，染色10 min为宜．总之，MSAP技术影响因素较多，各因素相互协调复杂，本研究通过对各参数的优化，建立的MSAP体系可以满足后续泡桐DNA甲基化变化分析的要求．

［1］ SAZE H，MITTELSTEN SCHEID O，PASZKOWSKI J．Maintenance of CpG methylation is essential for epigenetic inheritance during plant gametogenesis［J］．Nat Genet，2003，34(1):65 －69．

［2］ CHAN S W L，HENDERSON I R，JACOBSEN S E．Gardening the genome:DNA methylation Arabidopsis thaliana［J］．Nat ReV Genet，2005(6):351 － 360．

［3］ XIAO W，CUSTARD K D，BROWN R C，et al．DNA methylation is critical for Arabidopsis embryogenesis and seed viability［J］．Plant Cell，2006，18(4):805 － 814．

［4］ JULLIEN P E，KINOSHITA T，OHAD N，et al．Maintenance of DNA methylation during the Arabidopsis life cycle is essential for parental imprinting［J］．Plant Cell，2006，18(6):1360 －1372．

［5］ DAHL C，GULDBERG P．DNA methylation analysis techniques［J］．Biogerontology，2003，4(4):233 － 250．

［6］ 郭广平，顾小平，袁金玲，等．不同生理年龄毛竹DNA甲基化的MSAP 分析［J］．遗传，2011，33(7):794－800．

［7］ 李丽琴，付春华，赵春芳，等．红豆杉脱分化过程中的遗传和表观遗传变异［J］．植物生理学通讯，2009，45(6):544－548．

［8］ 洪 舟，施季森，郑仁华，等．杉木亲本自交系及其杂交种DNA甲基化和表观遗传变异［J］．分子植物育种，2009，7(3):591－598．

［9］ 魏华丽，吴 涛，杨文华，等．落叶松体细胞胚胎发生过程中DNA甲基化模式变化分析［J］．东北林业大学学报，2011，39(2):33 －37．

［10］ 李海林，吴春太，李维国．巴西橡胶树DNA甲基化的MSAP分析［J］．分子植物育种，2011，9(1):69－73．

［11］ 黎 明，翟晓巧，范国强，等．土霉素对豫杂一号泡桐丛枝病幼苗形态和DNA甲基化水平的影响［J］．林业科学，2008，44(9):152 －156．

［12］ 张延召，曹喜兵，翟晓巧，等．适用于AFLP分析的泡桐DNA提取方法研究［J］．河南农业大学学报，2009，43(6):610－614．

［13］ 陆光远，伍晓明，陈碧云，等．油菜种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析［J］．科学通报，2005，50(24):2750－2756．