张衷华 王 化 刘 英 祖元刚

(森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)是指细胞在一定的生理或病理条件下所发生的主动连续的程序化死亡过程［1］。鉴定植物细胞程序化死亡较可靠的方法为透射电子显微镜技术，但透射电子显微镜制样复杂，尤其在原生质体程序化死亡检测中受到限制，所以一般常用的方法包括DNA梯状条带法、末端脱氧核苷酸转移酶生物素dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling reaction，TUNNEL)、膜联蛋白 V(Annexin V)法等。并且需要2种以上的方法结合使用。Annexin V由于能够与程序化死亡早期细胞的细胞膜结合，被广泛应用于动物细胞的早期凋亡检测，O’Brien［2－3］较早将其应用于植物细胞的凋亡检测，我国学者徐昌杰［4］也应用此法成功检测了低氧胁迫下悬浮培养的苹果细胞的程序化死亡。但到目前为止，并没有将Annexin V应用于盐胁迫下原生质体早期凋亡检测的报道。本文应用膜联蛋白V－异硫氰酸荧光素(Annexin V－Fluorescein isothiocyanate，Annexin V－FITC)检测在不同盐胁迫下烟草原生质体的PCD，探索Annexin V－FITC检测法在盐胁迫下对原生质体PCD检测的应用。

1 试验材料

烟草(Nicotiana tabacum L.)种子播种于灭菌的培养皿中，并在人工气候箱中培养。气候箱设置为光照4级，相对湿度50% ～80%，温度22℃，每天光照12 h。种子发芽后移入石英砂中，定期浇灌Hoagland 培养液(配方:KH2PO41 mmol·L－1，KNO35 mmol·L－1，Ca(NO3)25 mmol·L－1，MgSO42 mmol·L－1，H3BO32.86 g·L－1，MnCl2·4H2O 1.81 g·L－1，ZnSO4·7H2O 0.22 g·L－1，CuSO4·5H2O 0.08 g·L－1，H2MoO4·H2O 0.02 g·L－1，乙二胺四乙酸铁盐溶液)。烟草幼苗长至4对完整叶片时，取最新发育的完整叶片提取原生质体。原生质体缓冲提取液为CPW盐，甘露醇调节渗透压，每10 mL缓冲液加入纤维素酶(cellulose from truchoderma Virde，Japan)0.08 g，离析酶(Macerozyme R－10，Japan)0.02 g。……