赵素君，曹 冶，谢 晶，李江凌，王秋实，叶勇刚，罗丹丹，叶健强，廖党金

（四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

肠毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是幼畜腹泻的重要病原菌，在临床上可引起幼畜急性严重腹泻。该病发病率高，传染性强，肠毒素是ETEC的直接致病因子[1－4]。由于PCR技术特异性强、灵敏度高和准确快速等优点，肠毒素基因的PCR扩增已经被越来越多地应用于肠毒性大肠埃希菌的检测[5－8]。但传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌，在活菌DNA和死菌DNA中均能扩增出目的基因[9－10]。死菌DNA的存在，也同样被检测到，其结果会导致过高估计活菌数量，并可能在没有活菌存在的情况下也会出现阳性检测结果（假阳性），从而干扰检测结果的真实性。

叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide，EMA）是一种荧光插入型核酸结合染料，能穿过死细菌的细胞膜，在光激活的作用下与基因组DNA共价结合，从而能抑制样品中死菌体的DNA扩增；而活细菌因具有完整的细胞膜而能阻止EMA渗透，使EMA对活菌体的DNA不起作用[11－14]。该技术在国内尚未见报道。本研究将EMA与PCR技术结合，在PCR扩增肠毒素基因目的片段的检测过程中，通过EMA选择性地与混合细菌菌落中的死细胞DNA共价结合，除去死细菌DNA对PCR扩增的干扰，可大大提高检测的准确性，以建立一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活细菌的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 阳性菌株：肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200；对照菌株：肠出血性大肠埃希菌CVCC248，肠侵袭性大肠埃希菌CVCC2072，肠致病性大肠埃希菌CVCC251，金黄色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056，猪霍乱沙门菌CVCC504，均购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保存管理中心。……