田文嘉 杜洪震 卞晓翠 李开龙

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院病理学系，北京 100005)

胰腺癌是消化道系统预后最差的恶性肿瘤之一，转移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔1，2〕。现有研究表明，在胰腺癌发生和发展过程中有多个基因突变，包括12个关键的信号传导途径，如TGF-β信号途径、鸟嘌呤三磷酸酶(GTPase)依赖的信号途径、Wnt/Notch信号途径和JNK信号途径等〔3〕，说明胰腺癌的发生、发展和转移是多基因、多信号途径参与的复杂的生物过程。因此，发现和验证与胰腺癌转移有因果关系的基因和信号途径对胰腺癌的诊断和治疗有重要意义。本实验结合全基因组基因突变技术和小鼠功能筛选，利用多克隆同步筛选和验证胰腺癌肺转移细胞亚群，从而得到与胰腺癌转移有高度关联的基因。

1 材料与方法

1.1 胰腺癌肺转移细胞亚群筛选前期基础 本实验室前期工作已经采用全基因组随机基因敲除技术平台 (RHKO)在人类胰腺癌细胞株AsPC-1建立了全基因组随机突变文库。RHKO的原理是通过能在真核细胞中高效整合的piggyBac转座子构建基因搜寻载体 (Gene Search Vector，GSV)，并将其随机插入基因组中，造成全基因组范围内的随机基因突变。在转录激活因子tTA的作用下，GSV中的TRE反应元件被激活，进而启动附近基因的转录。转录激活子tTA与TRE的结合还受到强力霉素 (Doxycycline，DOX)的调控，通过添加或者不添加DOX能够实现人为控制tTA是否激活TRE而启动附近基因的转录。此外，GSV中还包含新霉素抗性基因，使转入GSV的真核细胞可以利用G418筛选阳性克隆。……