赵艳红，施新革，吴军兵，王春仁

（1.中国食品药品检定研究院医疗器械检定所生物材料和组织工程室，北京 100050；2.国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心，北京 100044；3.新乡医学院第一附属医院骨科，河南 卫辉 453100；4.中国科学院生物物理学研究所，北京 100101）

烟雾凝聚物对人正常支气管上皮细胞中p16转录的抑制作用及其机制

赵艳红1，2，施新革3，吴军兵4，王春仁1

（1.中国食品药品检定研究院医疗器械检定所生物材料和组织工程室，北京 100050；2.国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心，北京 100044；3.新乡医学院第一附属医院骨科，河南 卫辉 453100；4.中国科学院生物物理学研究所，北京 100101）

目的：通过体外模拟吸烟过程来检测抑癌基因p16表达的变化，探讨p16基因在吸烟导致肺癌发生过程中的作用。方法：常规正常支气管上皮细胞（HBE）分为实验组和对照组，分别接受烟雾凝聚物和DMSO处理。利用免疫印迹和Realtime RT－PCR分别检测P16蛋白表达和mRNA的转录水平。构建p16的基因组启动子载体，利用荧光素酶分析烟雾凝聚物对其转录活性的影响。结果：不同浓度（0，10，25，50，100mg·L－1）的烟雾凝聚物处理HBE后，其p16的mRNA和P16蛋白表达水平明显降低，并且表现出剂量依赖性。大于25mg·L－1的烟雾凝聚物能明显抑制P16蛋白表达和mRNA的转录水平，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中100mg·L－1烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。烟雾凝聚物也能以剂量依赖方式抑制p16启动子的转录活性，大于25mg·L－1的烟雾凝聚物能显著抑制p16启动子的荧光素酶活性，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中100mg·L－1的烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。结论：烟雾凝聚物能够抑制p16启动子的转录活性，进而抑制P16蛋白的表达；P16蛋白表达水平的降低可能是吸烟导致肺癌发生的一种分子机制。

烟雾凝聚物；肺肿瘤；p16基因

p16基因也被称作多肿瘤抑制基因 （multiple tumor suppressor 1，MTS），是 Kamb 等［1］于1994年在美国冷泉港发现的抑癌基因。p16是一种细胞周期调控相关基因，直接参予细胞周期的调控，负性调节细胞增殖及分裂［2］。最新国外研究发现：p16与肺癌的发生密切相关，p16的缺失常见于非小细胞肺癌组织中［3］。p16缺失在与吸烟关系最为密切的鳞癌中发生率较高，而在腺癌中发生率相对较低［4］。目前国内尚没有关于p16在吸烟导致肺癌过程中的生物学作用的研究。本研究采用烟雾凝聚物来模仿吸烟过程，以正常支气管上皮细胞HBE作为研究对象，分析烟雾凝聚物对HBE中P16蛋白表达的影响以及潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人正常支气管上皮细胞HBE为本研究室保存。RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Invitrogen公司。Western blotting试剂盒购自美国Pierce公司。所有抗体均购自美国Abcam公司。Realtime PCR试剂盒购自Takara公司。双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司。细胞转染试剂Lipofactamine 2000购自美国Invitrogen公司。其他生化试剂购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养 人正常支气管上皮细胞HBE常规培养在完全培养基（RPMI1640＋10%FBS），培养条件为37℃、5%CO2。待细胞生长到融合度为80%～90%后，利用胰蛋白酶进行消化，重新接种。

1.3 烟雾凝聚物制备 将15支13mg焦油含量的红金龙牌香烟通过50mL注射器与收集瓶相连。通过抽吸装置，将点燃后香烟释放的烟雾收集到收集瓶中。将收集瓶置于液氮中使烟雾凝集，然后用DMSO将烟雾凝集物溶解，最终将浓度调整为10g·L－1。经过滤膜过滤灭菌后保存于－80℃冰箱中。采 用 不 同 浓 度 （0、10、25、50 和100mg·L－1）的烟草凝聚物处理HBE，36h后收集细胞进行后续实验。

1.4 实时定量PCR 利用Trizol试剂提取细胞总RNA，具体方法参见Invitrogen公司的说明书。将 RNA 定量后，利用 Takara公司的SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ （Perfect Real Time）试剂盒进行mRNA定量分析。引物序列如下：p16上游引物为5′－CAACGCACCGAATAGTTACG－3′，下游引物为5′－AGCACCACCAGCGTGTC－3′，扩增片段 171bp；18SRNA 上 游 引 物 为 5′－ACATCCAAGGAAGGCAGCAG－3′， 下 游 引 物 为 5′－TCGTCACTACCTCCCCGG－3′，扩增片段62bp。18SRNA作为内参基因。PCR体系为：SYBR○RPremix Ex Taq Ⅱ（2×），PCR Forward Primer（10μmol·L－1），Reverse Primer （10μmol·L－1），DNA模板50ng，灭菌蒸馏水，总体积20μL。PCR反应条件分为3个过程，分别是预变性（94℃、1min）、扩增反应 （94℃、5s，60℃ 、20s，共40个循环）及绘制熔解曲线（94℃降温到65℃后再升温到94℃）。目的基因相对表达水平采用2－△△CT方法来计算。即ΔΔCT＝（实验组目的基因CT－实验组内参基因CT）－（对照组目的基因CT－对照组内参基因CT）。为了更清晰表达各组之间表达水平的差异，本次研究将对照组的表达水平设定为100%。

1.5 免疫印迹（Western blotting）法 用细胞裂解液（150mmol·L－1NaCl，50mmol·L－1Tris－HCl pH 8.0，1%NP－40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1%SDS，2mg·L－1胰蛋白酶抑制剂）充分裂解细胞。

1.9 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。p16mRNA和p16启动子活性以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 烟雾凝聚物作用下P16蛋白的表达水平10mg·L－1的烟雾凝聚物处理HBE后，其P16蛋于冰上孵育30min后，4℃、15 000r·min－1离心20min后，收集细胞总蛋白。取5μg细胞总蛋白进行12%浓度的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。将蛋白通过半干转印仪转移到PVDF膜上。经过5%脱脂奶粉封闭0.5h后，与抗p16的第一抗体室温孵育2h。然后与HRP标记的兔抗羊第二抗体孵育1h，最后利用化学发光试剂盒（普利莱公司）检测荧光信号。利用Odyssey近红外双色激光成像系统采集信号。

1.6 细胞转染 利用Lipofectamine 2000试剂转染细胞，具体步骤参见Invitrogen说明书。当待转染细胞融合度达到90%左右后开始转染。用无血清RPMI－1640培养基分别稀释转染试剂和质粒。然后将二者充分混合，静置30min，加入到待转染的细胞中。4h后将培养基倒掉，加入含血清的完全培养基。

1.7 p16基因启动子构建 根据 Wang等［5］的报道，本文作者克隆了p16基因的启动子序列（－1～－3017）。本研究利用KpnⅠ和XhoⅠ核酸内切酶位点将该序列克隆到pGL3－basic载体中，该载体具有萤火虫荧光素酶ORS，其转录水平受插入序列的影响，即插入序列作为启动子影响荧光素酶基因的表达。将构建成功的载体命名为pGL3－basic－p16。

1.8 启动子活性分析 采用Promega公司Dual－Luciferase Reporter Assay System双荧光素酶报告系统进行启动子转录活性分析。具体步骤参见产品说明书。在96孔板内接种待转染细胞，待细胞融合度达到80%左右后，将pGL3－basic－p16和内参质粒pRL－SV40转染进入细胞内。48h后，弃去培养基，用PBS洗3遍，用PLB细胞裂解液裂解细胞后，加入LARⅡ检测液来检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入Stop＆Glo检测液来检测pRLSV40所表达的海肾荧光素酶活性。通过计算二者的比值，即能得到荧光素酶的相对活性（relative luciferase activity，RLA）。白表达水平变化不明显。当烟雾凝聚物的浓度提高到25mg·L－1以上时，P16蛋白表达水平明显降低。随着烟雾凝聚物浓度的升高，P16蛋白的表达水平也逐渐降低，100mg·L－1的烟雾凝聚物的抑制效应最明显。各组中内参基因β－actin的表达水平趋于一致。见图1。

图1 烟雾凝聚物作用下HBE中P16蛋白表达电泳图Fig.1 The electrophoregram of the P16protein expression in HBE after treated with cigarette smoke extracts

2.2 烟雾凝聚物作用下p16mRNA的表达水平10mg·L－1的烟雾凝聚物就能够引起p16mRNA表达水平轻度降低，但差异无统计学意义。随着烟雾凝聚物浓度的升高，p16mRNA的表达水平也逐渐降低，与对照组比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。100mg·L－1的烟雾凝聚物能够诱导高达38%的抑制效应。见表1。

2.3 烟雾凝聚物作用下p16基因启动子的转录活性 烟雾凝聚物能够抑制p16启动子的转录活性，具有一定的剂量依赖性。大于25mg·L－1的烟雾凝聚物均能明显抑制转录活性，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），100mg·L－1的烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。见表1。

表1 烟雾凝聚物作用下HBE中p16mRNA表达以及其启动子转录活性的变化Tab.1 The changes of p16mRNA expression and its promoter transcriptional activity in HBE after treated with cigarette smoke extracts

3 讨 论

吸烟与肺癌的关系已经在全世界范围内被广泛认可。烟草燃烧后形成的烟雾含有几千种化学成分［6－7］，其中包括多种致癌物质，这些致癌物进入人体后的代谢产物能够干扰正常的细胞生命活动，从而导致恶性肿瘤的发生［8］。烟草中的致癌物的代谢产物诱发癌变的分子机制：主要是通过诱导细胞内DNA加合物的形成［9］。DNA加合物形成后，不仅能导致癌基因的激活，也能导致抑癌基因的失活。p53是一个典型的烟草致癌物易感基因。近期多个研究［10］表明：烟草致癌物能够诱导p53基因的DNA加合物形成，从而导致p53基因失活。

p16基因是一个重要的抑癌基因，其编码产物是相对分子质量为16 000的核蛋白，因此被称作P16。P16的生物学功能主要是通过调节CDK4来实现的［11］。CDK4是一个参与细胞周期调控的重要基因，其控制着细胞周期的正常运转。CDK4能够与细胞周期素 （cyclin）相结合，二者周期性的结合和分离是细胞周期正常运转的必备条件。CDK4与Cyclin的复合体主要参与G1－S期转换的调控［11］。而P16蛋白能够抑制CDK4的活性，从而阻止细胞进入S期。如果p16基因发生缺失或突变等变异，则不能抑制CDK4的活性，从而使细胞进入无限恶性增殖状态，最终导致肿瘤发生。

目前，p16的缺失和突变已经在多种恶性肿瘤组织中被证实，尤其在肺癌组织中，p16存在广泛的缺失或突变［3，12］，这说明p16与肺癌的发生密切相关。本研究利用烟雾凝聚物来模仿吸烟过程，发现p16是烟雾凝聚物的一个易感基因。HBE经烟雾凝聚物处理后，p16mRNA与蛋白的表达水平变化呈现一致性，即均表现出不同程度的降低，说明P16蛋白表达水平降低可能是由于其转录水平改变造成的。进一步的p16基因启动子的转录活性分析证明了本文作者的推测，p16启动子的转录活性能够被烟雾凝聚物明显抑制。本研究结果提示：p16缺失可能在吸烟导致肺癌发生过程中起一定的作用。未来的临床流行病学与病理学研究将有助于深入认识p16与吸烟导致肺癌发生的关联性。

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［4］Witkiewicz AK，Knudsen KE，Dicker AP，et al.The meaning of p16 （ink4a）expression in tumors：functional significance，clinical associations and future developments［J］.Cell Cycle，2011，10（15）：2497－2503.

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Inhibitory effect of cigarette smoke extracts on p16transcription in human normal bronchial epithelial cells and its mechanism

ZHAO Yan－hong1，2，SHI Xin－ge3，WU Jun－bing4，WANG Chun－ren1
（1.Department of Biomaterials and Tissue Engineering，Institute for Medical Devices Control，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；2.Center for Medical Device Evaluation／SFDA，Beijing 100044，China；3.Department of Orthopedics，First Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University，Weihui 453100，China；4.Institute of Biophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

Objective To study the role of p16in cigarette smoking－induced lung carcinogenesis by detecting the expression of p16in human normal bronchial epithelial cells（HBE）after exposure to cigarette smoke extracts（CSE）and analyze the underlying mechanism.Methods HBE were treated with various doses of CSE or control DMSO and the protein and mRNA levels of p16were determined by Western blotting and Realtime RT－PCR respectively.The genomic promoter of p16was cloned and its transcriptional activity after exposure to CSE was determined by luciferase assay.Results After the treatment of different doses（0，10，25，50，100mg·L－1）of CSE，the mRNA and protein levels in HBE were significantly inhibited in a dose－dependent manner.More than 25mg·L－1of CSE conld significantly inhibit the p16mRNA and protein levels，there was significant difference compared with control group（P＜0.05）.100mg·L－1of CSE showed the greatest inhibiory effect.Moreover，the transcriptional activity of the promoter of p16was significantly suppressed by more than 25mg·L－1CSE，there was significant difference compared with control group（P＜0.05）.Conclusion Cigarette smoke extracts can inhibit the expression of p16by suppressing its transcriptional activity，indicating that p16might play a key role in cigarette smokinginduced lung carcinogenesis.

cigarette smoke extracts；lung neoplasms；p16gene

Q291

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0841－04

2012－05－17

国家自然科学基金资助课题 （30870792）

赵艳红 （1976－），女，辽宁省阜新市人，助理研究员，理学博士，主要从事肿瘤分子生物学和细胞生物学研究。

王春仁 （Tel：010－67095687，E－mail：chunrenwang＠263.net）

时间：2012－08－31 10：54

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20120831.1054.003.html