覃斐章，简 洁，焦 杨，黄仁彬

(广西医科大学药学院，南宁530021)

17-甲氧基-7-羟基—苯并呋喃查尔酮(YLSC)是从广西壮族的特色药材玉郎伞中分离的黄酮类新化合物，其分子式为C18H14O4，相对分子质量为294.3，已授权1项国家发明专利(200710034771.2)。实验表明，YLSC具有良好的心血管药理活性(如抗氧化、耐缺氧、抗凝血［1］等)，对体外培养乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧具有较好的保护作用，能明显增加心肌细胞的存活率，其机制与抗氧化、增加细胞膜表面的ATPase活性有关［2］。2011年6月，我们观察了YLSC对凋亡相关蛋白如凋亡信号调节蛋白1(Apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)、细胞色素 C(Cytochrome c，Cyt-C)、Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响，旨在进一步研究其对缺血再灌注诱导凋亡的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:SPF级SD大鼠，雄性，体质量200～250 g，由广西医科大学试验动物中心提供。②药物与试剂:YLSC，广西医科大学药理教研室提供，高效液相色谱法(HPLC)检测纯度为98%，用0.5%的二甲基亚砜(DMSO)溶解备用;盐酸地尔硫艹卓注射液;肝素钠注射液;细胞凋亡原位检测试剂盒;羊ASK1多克隆抗体;鼠Cyt-C多克隆抗体;鼠Bax多克隆抗体;Bcl-2鼠抗人多克隆抗体;IgGHRP;Immobilon-P试剂盒。③仪器:动物呼吸机器(上海奥尔科特生物科技有限公司);Western电泳仪(美国Bio-Rad公司);武汉俊杰JB-L5生物组织石蜡包埋机;Shandon切片机;奥林巴斯光学显微镜;重庆天海彩色病理图像分析系统。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、溶媒组、YLSC低剂量组、YLSC高剂量组、地尔硫组，每组10只。各组均于造模前10 min通过尾静脉注射药物2 mL/kg，所用药物前两组为生理盐水;溶媒组为含0.5%DMSO的生理盐水;YLSC低剂量、高剂量组为2.5 、5.0 mg/kg的YLSC;地尔硫组为盐酸地尔硫注射液2.0 mL/kg。各组均按照文献［3］复制大鼠心肌缺血再灌注模型。以ST段抬高0.1 mV或T波高耸，心肌变为暗红色作为心肌缺血标志;以ST段降低，T波逐渐恢复作为再灌注成功标志。假手术组仅穿线不结扎。实验结束后立即处死，取心肌组织用于下述实验。

1.2.2 心肌细胞凋亡率检测 用TUNEL法检测心肌凋亡细胞的分布情况。将每个心脏标本切为5片，每片取5个阳性视野，即每个标本计25个视野。正常细胞核呈蓝色;凋亡细胞核呈棕黄色，细胞核边集、染色质固缩、细胞体积变小，以阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡率。

1.2.3 ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax 蛋白表达检测 采用Western blot法检测抽提组织蛋白，Bradford法计算蛋白含量。取100μg蛋白样品，经十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后加入相应稀释倍数的一抗(ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax的抗体体积比分别为1∶2000，1∶500、1∶4000、1∶4000)，4℃孵育过夜。TTBS洗膜3次后加入相应的二抗工作液(兔抗羊IgG体积比为1∶2 000，马抗鼠 IgG体积比为1∶1 000)，室温孵育2 h，Immobilon-P 试剂盒显影成像。用Quantity One软件分析蛋白条带的光密度值，以目的条带的光密度值/内参GAPDH的光密度值作为蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量数据以¯x±s表示、组间比较采用t检验，率的比较行χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞凋亡情况 假手术组仅见个别散在的凋亡细胞;余五组凋亡细胞明显增加，YLSC低、高剂量组及地尔硫艹卓组凋亡细胞数均显著少于模型组(P＜0.01)，其中YLSC高剂量组显著少于低剂量组(P ＜0.05)，见表1。

表1 六组细胞凋亡率及凋亡蛋白表达(n=10，¯x±s)

2.2 ASK1、Cyt-C、Bcl-2、Bax 蛋白表达 与假手术组比较，余五组ASK1、Cyt-C蛋白表达均明显降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)，Bcl-2 蛋白表达明显升高(P＜0.01);与模型组相比，YLSC低、高剂量组 ASK1、Cyt-C、Bax蛋白表达均明显降低(P＜0.05或 P＜0.01)，Bcl-2 蛋白表达明显升高(P ＜0.01)，且呈YLSC剂量依赖性，见表1。

3 讨论

细胞凋亡在心肌缺血再灌注过程中起重要作用。在心肌缺血早期即可出现细胞凋亡，而在再灌注后细胞凋亡可变为爆发性增加［4］。细胞凋亡可使心肌细胞数量变少，心肌变薄伸展，功能性心肌梗死面积扩大，故梗死早期梗死面积的大小更多取决于细胞凋亡的严重程度［5］。尽早恢复血供，减少缺血再灌注引起的细胞凋亡，具有理论和临床实践双重意义。

心肌细胞凋亡由众多信号分子参与调节。ASK1处于凋亡信号调节的上游阶段，是p38活化蛋白激酶和 c-Jun NH2末端酶的上游激活因子。ASK1在炎症、氧化和应激状态下可被激活，表现为硫氧还原蛋白从ASK1上解离出来，激活的ASK1在调节细胞生长、生存和死亡方面起重要作用［6］。Cyt-C在细胞凋亡中亦起关键作用，可激活下游的caspase效应器，产生一系列的级联反应，从而引起细胞凋亡。Cyt-C的作用受Bcl-2蛋白家族调节，其中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL连接于线粒体外膜，可抑制Cyt-C自线粒体中释放，阻止Ca2+自内质网释放［7］;相反，促凋亡蛋白(如Bax)可促使Cyt-C和线粒体内膜其他蛋白质自线粒体中释放。Bcl-2与Bax的比值可间接反映细胞受凋亡因子调节的程度，改善Bcl-2和(或)Bax蛋白表达，增加Bcl-2/Bax值，可降低缺血再灌注后细胞凋亡率［8］。本研究显示，假手术组仅见个别散在的凋亡细胞，模型组凋亡细胞明显多于假手术组，YLSC低、高剂量组及地尔硫艹卓组凋亡细胞数均显著少于模型组，其中YLSC高剂量组显著少于低剂量组;与模型组相比，YLSC低、高剂量组ASK1、Cyt-C、Bax蛋白表达均明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高，且呈YLSC剂量依赖性。提示YLSC能降心肌缺血再灌注大鼠的心肌细胞凋亡率，增加抗凋亡蛋白如Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白如ASK1、Cyt-C、Bax的表达，对缺血心肌具有明显保护作用。

综上所述，YLSC能明显减轻缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡，其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达、下调ASK1、Cyt-C、Bax蛋白表达有关。

［1］简洁，林兴，张士军，等.玉郎伞两种黄酮单体的抗氧化、耐缺氧和抗凝血作用研究［J］.中药药理与临床，2009，25(3):22-23.

［2］简洁，刘曦，黄仁彬，等.玉郎伞两种黄酮单体对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2009，25(7):942-945.

［3］宋张娟，邱晓晓，王青，等.蛋白激酶C活性对缺血再灌注心肌环氧化酶表达的影响［J］.山东医药，2011，51(23):4-6.

［4］Assayag M，Gerstenblith G，Stern MD，et al.Long-but not shortterm heat acclimation produces an apoptosis-resistant cardiac phenotype:a lesson from heat stress and ischemic/reperfusion insults［J］.Cell Stress Chaperones，2010，15(5):651-664.

［5］彭章平，朱建华.现代缺血性心脏病学［M］.北京:人民军医出版社，2000:401.

［6］Yamaguchi O，Higuchi Y，Hirotani S，et al.Targeted deletion of apoptosis signal-regulating kinase1 attenuates left ventricular remodeling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(26):15883-15888.

［7］Zhang M，Zhang HQ，Xue SB.Effect of Bcl-2 and caspase-3 on calcium distribution in apoptosis of HL-60 cell［J］.Cell Res，2000，10(3):213-220.

［8］Skommer J，Wlodkowic D，Deptala A.Larger than life:Mitochondria and the Bcl-2 family［J］.Leuk Res，2007，31(3):227-286.