耿 倩，马 倩，邹玉安，薛 茜

(1河北北方学院，河北张家口075000;2河北北方学院第一附属医院)

在中国，脑卒中是仅次于癌症的第2位杀手，是威胁中老年人生命健康的常见神经系统疾病，其中缺血性脑血管病(ICVD)占56.6% ～80%，患者总人数达500万 ～600万，存活者致残率最高达约75%［1］。ICVD的防治已成为目前研究重点。2011年4月，我们观察了康脑液对脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞(NSC)增殖的影响，旨在为康脑液防治ICVD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 ①实验动物:健康雄性SD大鼠120只，体质量200～270 g，SPF/UAF级，购自北京大学医学部实验动物科学部［许可证号SCXK(京)2006-0008］。②药品及试剂:康脑液饮片(河北北方学院第一附属医院)，冷水浸泡一夜，煎煮2次，滤出药渣，将2次煎煮的药液混匀，文火分别浓缩成400%、200%、100%康脑液(每毫升分别含生药4、2、1 g)，置4℃冰箱保存备用;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU，南京探求生物技术有限公司)粉剂(按10 mg/mL溶解于生理盐水中)，兔抗鼠巢蛋白(Nestin)抗体(镇江厚普生物科技公司)，鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体(北京中山生物技术公司)。③实验仪器:电脑生物组织包埋机(浙江金华科迪仪器公司)，石蜡切片机(美国Thermo)，电脑生物组织摊片烤片机(浙江金华科迪仪器公司)，光学显微镜(日本OLYMPUS BX60型)，显微摄影装置(日本 NIKON)。

1.2 动物分组及处理 将120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及康脑液高、中、低剂量组，每组24只。五组均于术前7 d开始灌胃，其中康脑液高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/(kg·d)康脑液，假手术组及模型组给予等量蒸馏水，1次/d、直至处死。模型组及康脑液各组均根据Longa等研究，以线栓经右侧颈外动脉插线法建立右侧大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，假手术组仅切开动脉、不阻断。术后24 h五组均开始腹腔注射BrdU溶液50 mg/kg，1次/d、直至处死。

1.3 脑组织取材及BrdU、Nestin表达检测 ①脑组织取材:分别于缺血2 h再灌注后3、7、14、21 d各取6只处死取材:腹腔注射10%水合氯醛麻醉，经左心室插管至升主动脉，灌注肝素化生理盐水300 mL，4%多聚甲醛灌注固定30 min，快速断头取脑，以视交叉为中线将脑组织切成厚度2～3 mm的组织块，4%多聚甲醛液固定，常规石蜡切片，切片厚度为3μm。②BrdU、Nestin表达检测:采用免疫组化SP法。按照说明书操作，80℃烤片120 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min;微波中火，0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH值为6.0)修复10 min，自然冷却至室温;3%H2O2室温孵育10 min;正常山羊血清工作液封闭，室温孵育15 min，倾去、勿洗;滴加一抗(工作浓度为 1∶100)、4℃过夜，滴加生物素化二抗、37℃孵育15 min，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液、37℃孵育15 min;DAB显色，显微镜观察染色结果，以细胞呈棕黄色为阳性信号。每只大鼠取相同部位的切片各3张，每张切片在镜下(×400)随机选取缺血侧5个非重叠视野，计算阳性细胞数均值(阳性细胞数目/400倍视野)。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量数据以¯x±s表示，组内比较用方差分析，组间比较行t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

假手术组大脑皮质、海马部位有少量 BrdU、Nestin阳性细胞;余四组再灌注7 d时BrdU、Nestin阳性细胞开始增多，14 d达高峰、21 d开始下降，但各时间点均显著高于假手术组(P＜0.05或0.01);与模型组比较，康脑液各组BrdU阳性细胞数量在再灌注后各时间点均显著升高(P＜0.05或0.01)，Nestin阳性细胞数量在再灌注后第7、14、21天均显著升高 (P ＜0.05)，见表1、2 及图1、2。

3 讨论

表1 五组脑缺血再灌注后各时间点Brd U阳性细胞数比较(n=24，个，¯x±s)

表2 五组脑缺血再灌注后各时间点Nestin阳性细胞数比较(n=24，个，¯x±s)

图1 五组脑缺血再灌注后14 d缺血侧皮质Brdu表达(×400)

图2 五组脑缺血再灌注后14 d缺血侧皮质Nestin表达(×400)

自Eriksson等发现成年人脑中存在神经元发生现象后，成年人脑神经元不能再生的理论即被打破。众多研究表明，成年哺乳动物内源性NSC处于静止状态，改变内环境能激发静止状态的NSC并诱导其增殖、向病灶迁移，进而定向分化为成熟神经元以替代受损或缺失的神经元，实现自我修复。因此，利用神经细胞因子或药物等增强脑内源性NSC自我更替和修复能力可能是一种新的脑部疾病治疗途径，为ICVD的治疗提供了新的思路。中医认为，脑卒中发生主要是由于气虚血瘀所致，治疗原则以益气活血化瘀为主。目前研究发现，黄芪［2］、川芎［3］等单味中药的某些成分和复方芪棱汤［4］、通心络［5］、补阳还五汤［6］等均能促进神经再生。康脑液为临床经验方，由益气活血的鼻祖方补阳还五汤按照现代人的特点化裁而来，由黄芪、丹参、川芎、葛根、钩藤、三七等组成，临床用于治疗ICVD具有较好疗效。

BrdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，NSC发生分裂增殖后可作为底物参与DNA合成，被视为细胞增殖的标记。已有研究表明，脑缺血可促进大脑皮质、海马等处 NSC 增殖、迁移和分化［7～9］，且 NSC 增殖也有一定规律性，即神经再生并不是在脑缺血后短期内增强的，其再生能力在第10天左右达到峰值［10］。Nestin是NSC内一种特殊的中间丝蛋白，被视为其特异性标记蛋白［11，12］，其C末端大量的丝氨酸可能是磷酸化位点，丝氨酸的磷酸化可能影响Nestin与其他细胞骨架的结合。因此，Nestin很可能是一种自我保护性蛋白，有利于细胞存活及细胞骨架的稳重和重建，其重新表达在缺血脑周围可能增加脑组织的抗缺血能力，从而有利于神经系统功能的恢复。本研究显示，假手术组大脑皮质、海马部位有少量BrdU、Nestin阳性细胞;余四组再灌注7 d时BrdU、Nestin阳性细胞开始增多，14 d达高峰、21 d开始下降，但各时间点均显著高于假手术组;与模型组比较，康脑液各组BrdU阳性细胞数量在再灌注后各时间点均显著升高，Nestin阳性细胞数量在再灌注后第7、14、21 d显著升高。提示康脑液可通过上调BrdU、Nestin表达促进脑缺血损伤后内源性NSC增殖，此为其治疗ICVD的重要机制之一;但上调的确切机制尚不清楚，有待于进一步研究。

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