杨 浩，宋 涛，赵慧平，吕 中，陈 嵘

(武汉工程大学绿色化工过程教育部重点实验室，湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室，湖北 武汉 430074)

0 引 言

自从Binnig等[1]在1986年发明原子力显微镜(AFM)以后，AFM已逐渐成为生物学领域的重要的研究工具之一，并被广泛应用于分析各种生物细胞[2-4].AFM能够提供纳米级别的表面形貌信息，可在空气或液体中直接对样品进行检测，避免了样品的染色和超真空条件[5-6].同时，AFM在液相中可对细胞的生长和分裂进行实时动态的监控[7].AFM技术已被广泛用于检测生物细胞的机械性[8-9]、粘附性[10-11]、疏水性[12]、静电力[13]等性质及其免疫学研究[14].

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，简称大肠杆菌，为革兰氏阴性菌.大肠杆菌在自然界中分布广泛，大多数是不致病的，但有些侵入人体时可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等，因此大肠杆菌被认为是一种条件致病菌.大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌，作为一种模式细菌，大肠杆菌常被用来衡量抗菌剂的抗菌效果[15-17]，而通过AFM对大肠杆菌表面微观结构的观测则有利于理解抗菌剂对细菌的作用机理[18].

虽然AFM可用于观测生物细胞的微观结构，但若操作不当或参数设置不合理，则很有可能得不到清晰的图像或产生假图.本研究中，对影响大肠杆菌AFM图像质量的主要因素进行了探讨，并分析大肠杆菌细胞表面的形貌参数.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(CCTCC AB 90054)，由华中师范大学生命科学学院提供.将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，在37 ℃，150 r/min下震荡培养24 h，然后取一定量的原始菌液，稀释至OD660值为0.068～0.075.

实验仪器采用美国Veeco公司生产的Multimode型AFM.扫描采用RTESP型硅探针(Veeco)，共振频率为235～287 kHz，弹性指数为20～80 N/m，针尖曲率半径8 nm，正面角(15±2)°.

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 采用盖玻片作为AFM测试的基底.盖玻片分别经丙酮和无水乙醇超声清洗10 min，然后浸泡在无水乙醇中待用.由于微生物细胞具有生物活性，且细胞表面柔软，与AFM探针作用力较小时会得不到清晰的图像，因此在测量前需将细胞固定.固定前先用氮气将盖玻片表面吹干，然后用PBS缓冲液将菌液冲洗两次，在室温下加入质量分数2.5%的戊二醛PBS溶液，固定15 min.最后，移取20 μL的菌液滴在盖玻片上，自然晾干.

1.2.2 AFM测量 采用轻敲模式在空气中对大肠杆菌进行扫描，扫描范围为5 μm×5 μm，在此范围内可观察到十几到二十几个大肠杆菌细胞.记录AFM振幅(amplitude)图和高度(height)图.振幅图用来定性分析细胞表面特征，它比高度图更能直接观测到表面微观结构；高度图反映细胞的形貌，并用来定量分析大肠杆菌表面形貌参数，包括细胞的长度、宽度和高度.所有的图像和分析通过AFM自带的软件Nanoscope IIIa(版本号5.31r1)进行处理.大肠杆菌表面形貌参数的测定是通过对15个细菌的长、宽、高数据的统计结果.

2 结果与讨论

2.1 AFM扫描参数的确定

2.1.1 分辨率 分辨率的大小决定了AFM图像清晰度.图1是扫描频率为2 Hz，setpoint值为1.645 V，I/P值为0.6/0.7时，改变分辨率所得到的AFM振幅图.从图中可知，随着分辨率的增加，图像越清晰，图中所反映的表面细节越多，但当分辨率达到512时，细胞边界开始出现明显的条纹(图1c).这可能是因为分辨率的提高增大了探针与细胞间的作用力，而细胞较软，具有一定的粘附性，导致探针在扫描到细胞表面时发生了振荡.因而选择分辨为256较为适宜，此时可较清晰地观察到细胞的表面形貌和轮廓，细胞中间出现的裂痕说明细菌正处在分裂状态.

图1 大肠杆菌在不同分辨率下的AFM振幅图.Fig.1 AFM amplitude images of Escherichia coli under different resolutions注： a, b, c 分辨率分别为128, 256和512.

2.1.2 扫描频率 在图像不失真的前提下适当提高扫描速度可节省大量时间，而扫描速度主要取决于扫描频率和扫描范围.例如当扫描范围为5 μm×5 μm，扫描频率为2时，这时扫描速度为20 m/s.图2是分辨率为256，setpoint值为1.645 V，I/P值为0.6/0.7时，改变扫描频率所得到的AFM振幅图.对比图1b发现，当扫描频率减小时图像变得模糊，质量不佳(图2a)，而当扫描频率增大时由于探针快速移动而来不及响应反馈信息，图像出现明显波动，表面轮廓分辨不清(图2b).因此扫描频率定为2 Hz较适宜.

图2 大肠杆菌在不同扫描频率下的AFM振幅图.Fig.2 AFM amplitude images of Escherichia coli under different scanning frequencies注： a, b的频率分别为1 Hz 和3 Hz.

2.1.3 setpoint值 setpoint值表示探针与样品间作用力的大小.在轻敲模式中，当setpoint值增加时探针与样品的作用力会减小，而当setpoint值减小时探针与样品的作用力会增大.图3是分辨率为256，扫描频率为2 Hz，I/P值为0.6/0.7时，改变setpoint值所得到的AFM振幅图.由图可知，当setpoint值从1.645降至1.425时，图像没有发生明显变化，但如果setpoint值过小，探针会划伤细胞表面，甚至会损坏探针.因此，在不影响图像质量的前提下setpoint值应尽可能增大.而当setpoint值增加到1.813时，在图3b左侧较高的地方出现了几处跳针，并且继续增加setpoint值，AFM图像开始出现明显的失真，trace和retrace曲线不重合，得不到真实的表面形貌.因此，本实验的setpoint值定为1.645.

2.1.4I/P值I值(Integra1 gain，积分增益)和P值(Proportion gain，比例增益)主要用于设定探针对样品表面的跟踪反馈能力.I值比P值敏感，P值一般随I值而定，通常在数值上比I值大20%.图4是分辨率为256，扫描频率为2 Hz，setpoint值为1.645时，改变I/P值所得到的AFM振幅图.从图中可以看出，当I/P值在0.9/1.0时，图像出现很多干扰条纹，界面模糊不清，质量较差(图4b)；而当I/P值在0.3/0.4时，图像变得十分清晰，细胞表面形貌和边界较为明显，与图1b相比，表面上的一些条纹也消失不见(图4a).因此，最佳的I/P值为0.3/0.4.

图3 大肠杆菌在不同setpoint值下的AFM振幅图.Fig.3 AFM amplitude images of Escherichia coli under different setpoints注： a, b的setpoint值分别为1.425和1.813.

图4 大肠杆菌在不同I/P值下的AFM振幅图.Fig.4 AFM amplitude images of Escherichia coli under different I/P gains.注： a, b的I/P值分别为0.3/0.4和0.9/1.0.

2.2 大肠杆菌形貌分析

在确定好最佳的AFM扫描参数后，随机选取了一块5 μm×5 μm的扫描范围，记录下样品的AFM高度图，如图5a.在此范围内选取15个大肠杆菌，统计分析它们的长度、宽度和高度，分别得到图5b、5c和5d.结果表明，大肠杆菌的长度为(985.2±76.8)nm，宽度为(751.5±74.7)nm，高度为(168.4±39.3)nm，与以往的文献报道相近[19-21].这说明采用本实验所用的扫描方法可准确测量大肠杆菌的形貌特征参数.

图5 大肠杆菌AFM高度图(a)及表面形貌分析.Fig.5 AFM Height image of Escherichia coli (a) and surface morphology analysis.注： b, c, d分别是大肠杆菌的长度、宽度和高度的统计分析结果.

3 结 语

通过比较不同扫描参数下的振幅图，得到AFM对大肠杆菌扫描的最佳参数为：分辨率为256，扫描频率为2 Hz，setpoint值为1.645 V，I/P值为0.3/0.4.本实验所得到的大肠杆菌长度为(985.2±76.8)nm，宽度为(751.5±74.7)nm，高度为(168.4±39.3)nm，与文献报道相近.这些参数的准确获取为进一步研究微生物的生理变化以及抗菌剂的作用机理提供了先决条件.

参考文献：

[1] Binnig G, Quate C F, Gerber C. Atomic force micr-oscope[J]. Phys Rev Lett, 1986, 56(9): 930-933.

[2] Kuznetsov Y G, McPherson A. Atomic force micr-oscopy in imaging of viruses and virus-infected cells[J]. Microbiol Mol Biol R, 2011, 75(2): 268-285.

[3] Andre G, Kulakauskas S, Chapot-Chartier M-P, et al. Imaging the nanoscale organization of peptido-glycan in living Lactococcus lactis cells[J]. Nat Commun, 2010, 1:27.

[4] Dufrene Y F. Atomic force microscopy and chemical force microscopy of microbial cells[J]. Nat Protoc, 2008, 3(7): 1132-1138.

[5] 刘善堂. 扫描探针加工和自组装技术相结合的研究进展-表面图形可控的功能纳米结构的制备[J]. 武汉工程大学学报, 2007, 29(4): 1-4.

[6] 熊芳馨, 陈春晓, 刘善堂. 硅基上图案化自组装膜的制备及表征[J]. 武汉工程大学学报, 2011, 33(9): 4-8.

[7] Kailas L, Ratcliffe E C, Hayhurst E J, et al. Immo-bilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes[J]. Ultramicroscopy, 2009, 109(7): 775-780.

[8] Gaboriaud F, Dufrene Y F. Atomic force microscopy of microbial cells: Application to nanomechanical properties, surface forces and molecular recognition forces[J]. Colloids Surf B, 2007, 54(1): 10-19.

[9] Touhami A, Nysten B, Dufrene Y F. Nanoscale ma-pping of the elasticity of microbial cells by atomic force microscopy[J]. Langmuir, 2003, 19(11): 4539-4543.

[10] Yu L, Lu Z, Gan Y, et al. AFM study of adsorpt-ion of protein A on a poly(dimethylsiloxane) surface[J]. Nanotechnology, 2009, 20(28): 285101.

[11] Xu L C, Logan B E. Interaction forces measured using AFM between colloids and surfaces coated with both dextran and protein[J]. Langmuir, 2006, 22(10): 4720-4727.

[12] Dorobantu L S, Bhattacharjee S, Foght J M, et al. Atomic force microscopy measurement of hetero-geneity in bacterial surface hydrophobicity[J]. Langmuir, 2008, 24(9): 4944-4951.

[13] Rotsch C, Radmacher M. Mapping local electrost-atic forces with the atomic force microscope[J]. Langmuir, 1997, 13(10): 2825-2832.

[14] Hinterdorfer P, Baumgartner W, Gruber H J, et al. Detection and localization of individual antibody-antigen recognition events by atomic force micro-scopy[J]. Proc Natl Acad Sci, 1996, 93(8): 3477-3481.

[15] Xie Y, He Y, Irwin P L, et al. Antibacterial activ-ity and mechanism of action of zinc oxide nanopar-ticles against Campylobacter jejuni[J]. Appl Environ Microb, 2011, 77(7): 2325-2331.

[16] Ghosh S, Kaushik R, Nagalakshmi K, et al. Anti-microbial activity of highly stable silver nanopa-rticles embedded in agar-agar matrix as a thin film[J]. Carbohyd Res, 2010, 345(15): 2220-2227.

[17] Rai M, Yadav A, Gade A. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials[J]. Biotechnol Adv, 2009, 27(1): 76-83.

[18] Zhang W, Stack A G, Chen Y. Interaction force measurement between E. coli cells and nanopa-rticles immobilized surfaces by using AFM[J]. Colloids Surf B, 2011, 82(2): 316-324.

[19] Sahu K, Bansal H, Mukherjee C, et al. Atomic force microscopic study on morphological alterations induced by photodynamic action of Toluidine Blue O in Staphylococcus aureus and Escherichia coli[J]. J Photoch Photobio B, 2009, 96(1): 9-16.

[20] Arce F T, Carlson R, Monds J, et al. Nanoscale structural and mechanical properties of nontypeable Haemophilus influenzae biofilms[J]. J Bacteriol, 2009, 191(8): 2512-2520.

[21] Bolshakova A V, Kiselyova O I, Filonov A S, et al. Comparative studies of bacteria with an atomic force microscopy operating in different modes[J]. Ultramicroscopy, 2001, 86(1/2): 121-128.