索德成 李兰 樊霞

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

饲用酸化剂是指能够酸化饲料的一类物质。最初应用酸化剂仅作为改善饲料适口性的一种风味添加剂。随着科学的发展，人们更深认识到饲用酸化剂不仅可改善消化道pH值环境，保障动物有良好的消化环境，还能使饲料各组分在体内被充分消化吸收，保证有益菌群合理生长，病原微生物受到有效抑制，从而达到提高动物生长性能和饲料利用率、增强机体抗病能力的效果[1-3]。近几十年来，随着公众对饲用抗生素危害意识的提高，停用或减少抗生素作促生长剂的使用已成为必然的趋势。酸化剂被视为在猪饲料中能有效替代抗生素的产品之一，在动物饲养中得到广泛应用[4]。目前酸化剂不仅应用在仔猪生产中，在家禽、反刍动物上也有积极的效果。

市场也出现了各种类型的酸化剂。为了更好的掌握饲料酸化剂的产品质量和其中有机酸的含量，规范饲料酸化剂的生产和使用，需要建立一种简单、快速、准确的有机酸的检测方法。国内外报道的有机酸的检测方法主要有电位滴定法、毛细管电泳法[5-6]、气相色谱法[7-13]、液相色谱法[14-19]等。气相色谱法适用于少量沸点较低的有机酸。测量高沸点的酸要用硅烷化试剂衍生样品，方法繁琐，操作比较复杂；对热稳定性差和含量极低的有机酸难以测定。高效液相色谱法具有分析范围广、分析速度快等优点，在环境样品、食品、饲料酸化剂等有机酸成分分析中均有应用[14-19]。但对甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、丙酸的同步分离分析未见报道，本实验建立了利用液相色谱同步测定饲料酸化剂中5种有机酸的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BP310S/310 g型分析天平(赛多利斯公司，德国)；超声器(江苏金坛市医疗仪器厂生产)；Aglinet 1100型高效液相色谱（美国 Aglinet公司）：带有紫外检测器；Grom-sil分析色谱柱：250 mm×4.0 mm，粒径 5 μm(美国Grace公司生产)；甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸标准品:含量大于98%,购置于德国Dr.Ehrenstorfer公司；其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为Mili-Q纯化后的超纯水（＞18 MΩ）；硅酸钙载体由市场购得。

1.2 样品前处理

称取适量样品0.3～1.0 g（根据样品中各种酸的浓度）加入100 ml容量瓶中，加入2/3去离子水，超声提取30 min，用水定容至刻度。过0.45 μm微孔滤膜，上高效液相色谱测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：Grom－Sil柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；流动相：pH 值 2.5 磷酸水溶液；流速为 1.0 ml/min；检测波长：210 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

影响有机酸分离效果主要在于色谱柱的选择和流动相的选择，我们选用了Supelco gel C－610H、Agient AQ、agela ASB C18、Grom－Sil等色谱柱作为分离柱、使用不同pH值的水溶液作为基本流动相条件摸索检测有机酸的色谱条件。实验中发现采用C18柱分离有机酸时，乳酸和乙酸的保留时间基本一致，无法分离。采用Grom－Sil能比较好的分离5种有机酸，因此选用了Grom－Sil柱来分离。

不同的pH值、温度对有机酸的分离影响较大，pH值过高，会导致有机酸出峰过快，无法分离。pH值过低，保留增加，峰形较差，拖尾严重，丙酸和柠檬酸无法分离。在pH=2～2.5的磷酸溶液可使各种酸在色谱柱中达到完全分离，从而提高各组分的分离度和分离效率。色谱温度对有机酸的分离有很大的影响与pH值基本相同，温度过高会导致出峰重叠。最后确定流动相为pH值2.5磷酸水溶液，柱温为30℃。在此条件下，各种有机酸达到了良好的分离，标准溶液的色谱图见图1。

图1 甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸标准溶液的色谱

2.2 提取条件选择

甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸均易溶于水，并且酸化剂成分比较简单，大部分成分是有机酸和无机载体（或水）的混合物。因此提取液不需进一步净化，经滤膜过滤后就可以上机测定。

2.3 线性方程和检出限、定量限

配置浓度为10～500 μg/ml甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸混合标准溶液，以上述条件进行检测，以峰面积与标准溶液的浓度作标准曲线。线性实验结果见表1，可见各种有机酸标准溶液在10～500 μg/ml的范围内线性关系良好。

表1 有机酸线性关系

在本实验条件下,将标准溶液连续稀释后进行空白样品的加标回收,根据10倍噪音的峰响应值、取样量和进样量,得出方法的定量限，具体结果见表1。

2.4 回收率与精密度实验

精密称取空白硅酸钙载体0.5 g于100 ml棕色量瓶中，添加不同量甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸标准溶液制成含1%、10%的样品；精密称取空白硅酸钙载体0.5 g，分别添加甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸标准溶液制成含30%酸化剂；另取已知含量固体酸化剂0.3 g于100 ml棕色量瓶中，添加适量甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、柠檬酸标准溶液使其添加浓度为1%、10%。每个样品5个重复，按上述方法进行检测，测得回收率和变异系数结果见表2。可见在1%～30%添加水平，方法回收率均大于85%，相对标准偏差为0.8%～9.9%。结果表明，该方法测定5种有机酸含量测定的准确度和精密度均表现良好。

3 实际应用

表2 添加回收率和精密度实验结果

应用建立的方法，对从市场上获得已知含量的饲料酸化剂进行测定，检测结果见表3。该检测结果表明：本方法能满足对饲料酸化剂中甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、丙酸的检测需求。

表3 已知含量的酸化剂实验结果（%）

[1]赵先铭,曾清华,丁永忠.酸化剂的作用机理及其应用[J].中国饲料，2002,11:22-23.

[2]秦圣涛,张宏福,唐湘方,等.酸化剂主要生理功能和复合酸选配依据[J].动物营养学报,2007,1:515-520.

[3]林海丹,邓宇翔,王松波,等.饲用酸化剂的作用机制和应用现状[J].广东饲料,2009,05:23-25.

[4]李祥,张子宏.饲料酸化剂替代抗生素的作用机制[J].饲料研究，2006,09:22-24.

[5]Inés Mato,Silvia Suárez-Luque,José F.Huidobro.Determination of main organic acids in grape juice and wine by using capillary zone electrophoresis with direct UV detection[J].Food Chemistry,2007,102(1):104-112.

[6]Inés Mato,José F.Huidobro,Jesús Simal-Lozano,et al.Simultaneous determination of organic acids in beverages by capillary zone electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta,2006,565(2):190-197.

[7]王洪丽,李成云.气相色谱法测定苜蓿青贮料中的有机酸[J].饲料工业，2008,29(16):58-60.

[8]E.Hautala,M.L.Weaver.Separation and quantitative determination of lactic,pyruvic,fumaric,succinic,malic,and citric acids by gas chromatography[J].Analytical Biochemistry,1969,30(1):32-39.

[9]Petr Verner Separation.Quantification and identification of nonvolatile organic acids in body fluids by gas chromatography[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,1998,6(2):131-150.

[10]Veronika Dufková,Radomír,Doubravka Maradová,et al.fast derivatization procedure for gas chromatographic analysis of perfluorinated organic acids[J].Journal of Chromatography A,2009,1216(49):8659-8664.

[11]李建红,王志畅.气相色谱法测定土壤中丙酸、苹果酸、柠檬酸[J].东华理工学院学报，2006,04:376-378.

[12]李琼,刘乐全,徐怀德,等.光皮木瓜中有机酸成分研究[J].西北农业学报，2008,01:207-210.

[13]任清.衍生化毛细管气相色谱法同时测定饲料添加剂中富马酸、乳酸和柠檬酸[J].分析化学，2002,30:304-306.

[14]庞新安,万英.反相高效液相谱法测定果品中有机酸[J].中国食物与营养，2007,11：40-41.

[15]毕丽君，张骊，张鸿发.固相萃取高效液相色谱法分析酱油中有机酸[J].分析化学，2000,28（11）:1391-1394.

[16]Tomás Pérez-Ruiz,Carmen Martínez-Lozano,Virginia Tomás,et al.High performance liquid chromatographic separation and quantification of citric,lactic,malic,oxalic and tartaric acids using a post-column photochemical reaction and chemiluminescence detection[J].Journal of Chromatography A,2004,1026(1-2):57-64.

[17]Zohar Kerem,Ben-ami Bravdo,Oded Shoseyov,et al.Rapid liquid chromatography-ultraviolet determination of organic acids and phenolic compounds in red wine and must[J].Journal of Chromatography A,2004,1052(1-2):211-215.

[18]谢明,吴莹莹,侯水生.饲料有机酸化剂中乙酸、柠檬酸的高效液相色谱检测分析[J].饲料工业，2004，25（10）:51-52.

[19]吴剑平,商军.高效液相色谱法同时测定复合有机酸化剂中5种成分的含量[J].中国饲料，2008，14：36-39.