李欧静，张桂华，兰青阔 ，王 永 ，赵 新 ，朱 珠 ，陈 锐，郭永泽

（1.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381；2.天津科润农业科技股份有限公司，天津 300192）

蔬菜种子纯度是种子质量的重要指标，其鉴定方法有田间形态试验、RAPD、SSR、同工酶标记等，但这些方法在操作性、稳定性、多态性等方面不能满足目前的需要。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。近年来，SNP标记以其二态性、等位基因性、高密度性以及高遗传稳定性等优点成为研究热点，被广泛应用于农作物遗传学研究[1]和品种鉴定当中[2]。

焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是实时、定量分析DNA序列的新一代测序技术，是基于引物引导的多聚酶延伸下的核酸合成的新型DNA测序技术[3]，具有操作简单、费用低、通量高、结果准确和自动化程度高等优点，特别适合SNP、small InDel等短序列分析，具有较高的灵敏性和准确性。Pyrosequencing技术的另一突出优势在于与DNA池（DNA Pooling）技术的结合应用。Pooling技术的原理是将已知对照样本和多个未知样本混合在一起进行PCR扩增，PCR产物经基因分型、最后用统计学方法对数据进行分析，得到已知样本在总样本中的比例[4]。Pyrosequencing和Pooling联用技术兼有Pyrosequencing的定量测序优点和Pooling高通量的优点，特别适用于大规模样品的等位基因频率分析[5]，能满足种子纯度鉴定大样本量的需求。

笔者分析了黄瓜SNP位点CLA13（C/G）在16个黄瓜育种材料中的多态性，结合Pyrosequencing和DNA Pooling技术，建立3Pooling SNP Pyrosequencing标准曲线，快速、高效的鉴定黄瓜种子纯度，旨在为后续的品种鉴定及大批量的蔬菜种子纯度鉴定奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料：16个黄瓜杂交种及其母本、父本的基因组DNA由天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 SNP位点的选择及引物设计 经网络数据库检索、验证获得黄瓜SNP位点CLA13（C/G），利用PSQ Assay Design软件设计用于焦磷酸测序的PCR引物、测序引物以及需要分析的目标序列（Sequence to Analyze），其中前引物5’加生物素（Biotin）标记修饰见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 CLA13（C/G）位点焦磷酸测序引物序列

1.2.2 焦磷酸测序反应 包括用于制备测序反应模板的PCR扩增和焦磷酸测序反应[6]。PCR扩增采用50μL反应体系，其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）25μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1μL，DNA模板100 ng，灭菌去离子水补足至50μL。反应程序为94℃预变性5min；50个循环反应（94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 40 s）；72℃延伸 7 min；4℃保存。PCR仪为ABIverity 96 well Thermal cycler。

焦磷酸测序反应在PyroMark ID焦磷酸测序仪（Biotage）上进行。PCR产物中加入47μL Binding buffer（Biotage）和 3 μL Sepharose beads（Biotage），1 300 r/min涡旋混匀 15 min，经 Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer（Biotage）和1.2μL测序引物（10 μmol/L）的PSQ 96测序反应板中，80℃金属加热块（Labnet）上加热2min后冷却至室温。将酶、底物和A、T、C、G 成分（Qiagen）加入试剂仓，即可上机测序。测序结果可通过分型分析模式（Genotyping）直接获得样品SNP类型，或者通过等位基因频率AQ（Allele Quantification）模式分析C基因型频率C%和G基因型频率G%。

1.2.3 DNA Pooling最适数量的确定 取3号杂交种（基因型记为C/G）及其父本（基因型记为C/C）基因组DNA，精确稀释至20 ng/μL，按照C/C与C/G 的比例为 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 和1∶19 进行混合，模拟 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 个杂交种Pooling中混杂1个C/C的情况。将上述10种充分混匀DNA模板进行PCR扩增及焦磷酸测序分析，获得C等位基因频率C%和G等位基因频率G%（G%=1-C%）。试验设置10次重复。

1.2.4 3 Pooling SNPPyrosequencing标准曲线的建立 取3号杂交种（C/G）及其母本（G/G）、父本（C/C）的基因组 DNA（20 ng/μL），按照 C3（3C/C）、C2（2C/C∶1C/G）、C1（1C/C∶2C/G）、Hybrid（3C/G）、G1（1G/G∶2C/G）、G2（2G/G∶1C/G）、G3（3G/G）的梯度比例混合DNA模板，进行PCR扩增和焦磷酸测序，分析等位基因频率C%，并建立C%与不同梯度的标准曲线。

1.2.5 3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型样品检验 选择SNP位点为C/G分型的黄瓜杂交品种8号进行样品检验试验。选颗粒饱满、大小均匀籽粒30粒，浸泡、萌发、每3个种子DNA等量混合，进行PCR扩增、焦磷酸测序以及等位基因频率分析。根据建立的标准曲线模型，换算出其中来自亲本的污染。

1.2.6 数据分析 SNP多态信息量PIC值使用PIC_CALC软件计算，TTEST和标准曲线制定使用office excel软件完成。

2 结果与分析

2.1 CLA13（C/G）位点分型及多态信息量分析

对16个黄瓜杂交种及其亲本的CLA13（C/G）位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析，分型结果见表2。在16个子代中，7个检测为C/G杂合，因此CLA13（C/G）位点适合7个品种做黄瓜种子纯度鉴定试验。进一步对CLA13（C/G）位点多态信息量（PIC）分析表明，在16个黄瓜杂交种的群体中该SNP位点PIC达0.556，处于高度多态。

2.2 DNA Pooling最适数量的确定

为提高种子纯度检测效率，研究引入DNA Pooling技术，通过分析DNA Pooling中SNP位点的等位基因频率，确定样品的杂合程度，并转换为种子纯度。按一定梯度比例混合C/C基因型和C/G基因型DNA，模拟不同DNA Pooling，并通过比较不同DNA Pooling下等位基因频率差异显著性，确定最适DNA Pooling。

表2 16个黄瓜杂交种及其亲本CLA13（C/G）位点分型分析

如表3所示，随着Pooling数量的增加，C%平均值逐渐下降并接近50%。对2～20 Pooling C%值进行TTest分析显示，4 Pooling以下呈显著差异水平，3 Pooling以下呈极显著差异水平。考虑试验的准确性和可靠性，选择3 Pooling作为最佳Pooling数量，即在种子纯度检测过程中，将3粒种子作为1个Pooling进行检测具备较高的效率和准确度。

2.3 3 Pooling SNPPyrosequencing标准曲线的建立

为了把C等位基因频率转换为3 Pooling中杂交种的数量，需建立3 Pooling SNPPyrosequencing标准曲线。结果显示，随着C3-G3七个梯度样品中C基因降低和G基因升高，焦磷酸测序峰图（图1A）中C碱基峰高从后续碱基T、C、G的1倍峰高逐步降低为0，G碱基峰高从0逐渐升高到与后续碱基T、C、G的峰高持平；建立C%与C3-G3七个梯度样品标准曲线（图1B），两者呈线性关系，R2达0.998 2。参考该标准曲线，可通过画图比较或计算的方法将C%转换出3 Pooling样品中是否含有或含有几粒C/C或G/G类型种子。

表3 不同DNA Pooling数量C等位基因频率分析

图1 3Pooling下C梯度测序结果及标准曲线

2.4 3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型样品检验

如表4所示，10个Pooling中第1 Pooling C%值为65.3%，第7 PoolingC%值为66.2%，说明第1 Pooling和第7 Pooling的3粒种子中含有1个C/C类型的种子，而其他8个Pooling均为C/G类型的种子。因此，该30粒种子中含有2粒非杂交种，纯度可记为93.3%。

表4 3Pooling检验黄瓜杂交品种种子纯度结果

3 讨论与结论

种子纯度是指杂交种后代表型的一致性，是黄瓜种子质量的重要指标。造成黄瓜种子纯度低的主要原因有亲本纯度不够高、生物混杂和机械混杂等原因，其中来自母本的混杂较为普遍。因此，杂交种中母本基因型的检测是分子检测的重点。SNP分子标记是继SSR标记以后的第三代分子标记，具有高密度和高度遗传稳定性等优点，而且大多数只有两种等位基因型，所以也被称为双等位基因标记（biallelic marker），能够明显区分出母本、父本及杂交种基因型。因此，SNP分子标记适合于黄瓜品种真实性和纯度检测的要求。

研究将SNP标记技术、Pyrosequencing技术和DNA Pooling技术有机结合，建立3 Pooling SNP Pyrosequencing种子纯度检测分析模型，克服了RAPD、SSR等分子标记技术必须凝胶电泳的瓶颈，提高了黄瓜杂交种纯度鉴定效率。同时，3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型可应用于其他作物种子纯度鉴定，具有推广价值和应用前景。

[1] 李兆波，吴 禹，王 岩，等.SNP标记技术及其在农作物育种中的应用[J].辽宁农业职业技术学院学报，2010，5（12）：8-9.

[2] Jung JK，Park SW，Liu W Y,et al.Discovery of single nucleotide polymorphism in Capsicum and SNPmarkers for cultivar identification[J].Euphytica，2010，175（1）：91-107.

[3] Pati N，Schowinsky V，Kokanovic O，et al.A comparison between SNa Pshot，pyrosequencing，and biplex invader SNP genotyping methods：accuracy，cost，and throughput[J].J Biochem Biophys Methods,2004 ，60（1）：1-12.

[4] 李树珍，万慧荣，杨 光.DNA池结合DHPLC和直接测序技术在江豚 SNPs检测中的应用[J].兽类学报，2009，29（2）：185-190.

[5] Lin Y S，Liu FG，Wang T Y，et al.A simplemethod using PyrosequencingTM to identify de novo SNPs in pooled DNA samples[J].Nucleic Acids Research，2011，39（5）：28.

[6] 兰青阔，张桂华，王 永，等.基于InDel标记快速检测黄瓜津优38 种子纯度[J].种子，2011，30（6）：19-23.