李全健 ，王彩霞 ，田 敏 ，李翠新

（1.西南林业大学，云南 昆明 650224；2.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）

扇脉杓兰（Cypripedium japonicum Thunb.）属兰科（Orchidaceae）杓兰属（Cypripedium Linn.），生于海拔1 000～2 000 m的灌木林下、林缘、荫蔽山坡等湿润和腐殖质丰富的土壤上[1]。目前对于扇脉杓兰的研究主要集中在传粉生态学[2]方面，有关扇脉杓兰分子生物学相关的研究尚未见报道。

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是限制性片断长度多态性（RFLP）技术和聚合酶链式反应（PCR）技术的结合[3]，是一种理想的分子标记技术。已经在杜仲[4]、苹果[5]、葡萄[6]等多种植物[7-8]上建立了AFLP体系，并对菊花[9]、红花[10]等多种植物进行了遗传多样性研究。尽管AFLP标记技术应用广泛，但是其操作复杂，操作中的影响因素较多。建立扇脉杓兰AFLP体系，对进一步研究其种质资源多样性和分子标记辅助育种有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为野生扇脉杓兰嫩叶，取材后立即放入冰盒中带回实验室，保存在-80℃冰箱中。

1.2 方法

SDS 法[11]、高盐低 pH 法[12]、常规 CTAB 法[11]、高盐CTAB法（将常规CTAB法提取缓冲液中的Na－Cl的浓度由 1.4mol/L增至 2.0mol/L，其它和常规CTAB法相同）和改良CTAB法。

试验步骤：将材料研磨成粉末后，取约50 mg的冻粉于离心管中再加入CTAB（50mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、0.7 mol/L NaCl）200 μL 和10μLβ-巯基乙醇，充分混匀后加入800μL 65℃预热的CTAB和10μL蛋白酶K，颠倒数次，65℃恒温水浴 60 min，10 min/次摇匀；取出冷却后加入800 μL 酚∶氯仿∶异戊醇（体积比为 25∶24∶1），颠倒混匀 2 min，静置 5 min后12 000 r/min离心 15 min；取上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇（体积比为24∶1）颠倒 2 min，静置5min后12 000 r/min离心 15 min；取上清液，加1/10体积5mol/L的醋酸钠和等体积的异丙醇，沉淀15 min。8 000 r/min离心10 min，去上清；70%乙醇洗涤两次，风干后溶于400 μL去离子水；……