尹广利 王植荣 郭艺芳 冯子南 王庆海 刘芳茹 杨宝刚 王庆凯

近年研究表明，人体血压呈现为典型的近日节律性(circadian rhythm)，且这种节律现象的发生与内皮源性血管活性物质内皮素1(endothelin1，ET-1)和一氧化氮(nitric oxide，NO)活性水平的昼夜波动具有密切关系［1］。许多学者发现改善血压的基本节律特征与降低血压的均值同等重要。珍菊降压片是临床治疗高血压病的常选药物之一，由野菊花膏粉、珍珠层粉、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁组成的中西药复方制剂。为了解珍菊降压片与钙离子拮抗剂联用后对血压及血管内皮功能的昼夜节律影响，并探索一种传统中药制剂与西药相结合治疗高血压的新方法，我们以大鼠为实验对象，比较了联服珍菊降压片、氨氯地平片与单服氨氯地平片前、后血ET-1、NO和收缩压昼夜节律变化，为探讨抗高血压药物对血压、内皮源性物质昼夜节律的影响以及中西药物干预效果奠定坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

清洁级健康10周龄SD大鼠64只(购自河北医科大学实验动物中心)，体重250～300 g，雌雄各32只，常规饲养于河北省沧州中西医结合医院实验室，自由进食，室温维持在(22±2)℃。适应性饲养1周后，随机分为两大组:(1)灌服苯磺酸氨氯地平片组(组Ⅰ):32只，每日给予苯磺酸氨氯地平片2.5 mg·kg－1·d－1灌胃(由辉瑞公司提供);(2)灌服苯磺酸氨氯地平片和珍菊降压片组(组Ⅱ):32只，每日在灌服苯磺酸氨氯地平片基础上，给予珍菊降压片 40 mg·kg－1·d－1(每片珍菊降压片含有野菊花膏粉100 mg、珍珠层粉100 mg、盐酸可乐定30 ug、氢氯噻嗪5 mg、芦丁20 mg)灌胃，分早、中、晚3次灌服。每大组又分4小组，每小组各8只。

1.2 方法

1.2.1 血压测定 所有大鼠灌胃前1 d和灌胃后4周末，采用RBP-1B型光电法鼠尾测定仪(中日友好医院生产)于不同时间点(02∶00、08∶00、14∶00、20∶00)测定大鼠的收缩压，每个时间点分别测量两大组中各一小组大鼠的收缩压。

1.2.2 动物处死及取材 灌胃后4周末，分别于不同时间点(02∶00、08∶00、14∶00、20∶00)处死大鼠，每次分别处死两大组中各一小组大鼠，取血2 ml置入盛有10%依地酸二钠30 μl、抑肽酶20 μl的 EP管中，低温离心，3000转/min，留取血浆，－20℃保存备用。取血6 ml置入试管中，低温离心，300转/min，留取血清，－20℃保存备用。

1.2.3 指标测定 采用放射免疫测定ET-1含量。药盒购自解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所，按说明书操作。采用硝酸还原酶法测定NO水平。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 统计学方法

应用余弦拟合法(cosine fitting)统计分析软件进行统计学处理，以Yi=M+Acos(ωti+Φ)为基本模型［2］。式中Yi为 ti时刻收缩压和血液中 ET-1、NO含量;M是余弦曲线的中值;A为曲线的振幅;ω为曲线的角频率;Φ为峰值相位(亦即峰值时刻的角频率)［2-3］。在本研究中，Yi为收缩压和血液中ET-1、NO 含量;ω =2π/τ即 360/24=15，即将 24 h视作360度角，每小时相当于15度角;ti代表24 h制的时间，即0、1、2……23 h;其余则为待测或计算值。将每只大鼠24 h中每次的测定值代入前述模型，然后根据最小二乘法(the least square)原理，采用组平均余弦拟合法做拟合度检验，如P＜0.05则接受检验假设，说明该指标的分布节律可由上述模型正确描述。然后采用零振幅检验(zero amplitude test)［2］评价各指标的近日节律是否确实存在，如P＜0.05则说明该指标呈现为昼夜节律，而非无节律的随机分布。同时求得余弦分布曲线的各个特征值，即M、A及Φ。应用t检验，比较两组大鼠灌胃前后拟合曲线特征值的差异显著性，如P＜0.05则视为差异有统计学意义。

表1 两组大鼠服药前后不同时段检测结果(±s)

表1 两组大鼠服药前后不同时段检测结果(±s)

注:与治疗前相比，aP＜0.05，与组Ⅰ比，bP＜0.05

组别 收缩压(mm Hg)ET-1(ng/L)NO(μmol/L)治疗前 治疗后组Ⅰ治疗前 治疗后 治疗前 治疗后02∶00 106.2± 7.1 84.6±10.9b 110.4±20.7 87.9±14.3b 30.5± 5.6 64.3±10.5b 08∶00 96.8± 4.1 94.6±12.1b 100.3±13.1 84.0±18.6b 28.6± 3.8 30.4± 3.7b 14∶00 108.0± 7.9 101.0± 5.1b 97.5± 5.8 85.1± 2.6b 26.6± 3.3 55.8±12.1b 20∶00 101.6± 8.9 96.2± 7.8b 73.4± 3.9 63.6± 4.2b 32.5±10.1 38.2± 8.7b组Ⅱ02∶00 105.2± 7.3a 78.8± 7.9b 109.3±10.7a 75.4± 9.7b 31.1± 5.6a 74.5±10.1b 08∶00 95.6± 3.4a 86.8± 8.8b 102.3±10.3a 72.2± 5.9b 27.6± 4.7a 54.2± 5.6b 14∶00 112.0± 7.4a 90.2± 4.0b 97.8± 6.1a 65.4± 4.9b 24.5± 3.3a 62.2±10.6b 20∶00 100.6±10.1a 89.6± 7.1b 70.4± 4.4a 62.5± 6.9b 30.5± 8.8a 40.3± 8.8b

2 结果

组Ⅰ、组Ⅱ治疗前收缩压、血ET-1和NO比较差异无统计学意义(P＞0.05，表1)，组Ⅰ、组Ⅱ治疗后血浆ET-1水平均降低、血清NO均升高，但与组Ⅰ相比，以组Ⅱ治疗后血ET-1和NO水平变化差异更显著(P＜0.05，表1)。组Ⅰ、组Ⅱ治疗后收缩压均明显降低(P＜0.05，表1)，但组Ⅱ下降幅度更大(P＜0.05，表1)。

应用最小二乘法对各组大鼠服药前后收缩压、血ET-1和NO进行余弦拟合，得出余弦拟合曲线的特征值(表2)。对其行零振幅检验，各组均示P＜0.05，即拒绝曲线振幅为零的检验假设，表明两组治疗前后收缩压、血ET-1和NO曲线均呈节律性分布。换言之，各组曲线的基本昼夜节律均存在。分析各曲线的特征值可见，两组大鼠治疗后收缩压及血浆ET-1曲线的中值均减小，血清NO曲线的中值增加(P＜0.05)，但组Ⅰ变化幅度较小。此外，两组大鼠经治疗后收缩压、血ET-1和NO曲线峰值相位均发生了不同程度移位(P＜0.05)。

表2 两组大鼠治疗前后各种检测结果的时间生物学特征的变化

3 讨论

正常情况下，人体血压及心血管系统的其他生理活动均表现出较为典型的近日节律［4］。近年来大量研究表明，血压的昼夜分布节律与高血压患者预后及合并症的发生有密切关系。因此许多学者认为，纠正异常的血压节律与降低血压同等重要。高血压的机制之一是内皮功能受损，导致ET-1/NO失衡。如能逆转失调的内皮功能是当前高血压治疗的新趋势［5］。因此，研究这些体液因子的昼夜节律性及降压药物对其节律性的影响，对于深入认识血压的时间生物学调节机制具有重要意义。

本研究旨在探讨药物是否对血压昼夜节律有影响。为避免高血压所致的血压昼夜节律异常，更清晰的认识药物对节律的影响，本研究选用了血压正常的大鼠。这种设计方案有助于充分认识血压及血管活性物质的生物节律现象，对于进一步研究血压生物节律的形成与维持机制以及药物的可能影响具有重要意义。国内最新的高血压防治指南提倡联合治疗。目前传统和新型西药间的联合较多，而传统中药制剂与西药间的联合临床报道较少。珍菊降压片为中西药物组成的常用复方降压制剂，其质量标准已收载于部颁中药20册，标准编号WS3-B-3925-98［6-7］。研究表明，珍菊降压片能增加 NOS 及mRNA的表达，升高NO含量，保护和修复内皮细胞，调节体内 NO和 ET-1平衡，从而降低血压［8］。Asanuma等［9］发现氨氯地平片能增加NO释放，改善内皮功能。珍菊降压片与氨氯地平片在改善血管内皮功能和降压方面能产生良好的协同作用。本研究显示，珍菊降压片和氨氯地平片中西药物联合应用可进一步使NO增加，更好的保护血管内皮功能，从而进一步控制血压。同时本研究发现，两者联合应用还可以降低ET-1水平，具体机制还有待进一步证实。

总之，珍菊降压片联用氨氯地平片后在改善血管内皮功能方面具有良好协同作用，较单服氨氯地平片有更好的血压控制作用，符合当前降压治疗的新趋势。可作为传统中药制剂与西药相结合治疗血压的又一有效方法。本研究显示，应用珍菊降压片和氨氯地平片后血ET-1、NO及收缩压均呈现昼夜节律现象，而节律的维持可进一步保护靶器官，减少心脑血管并发症的发生率，有待随机对照的大样本临床试验进一步证实。

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