孙运良 满晓华 王丽华 吴红玉 李淑德

1.江苏省赣榆县人民医院消化内科，江苏 赣榆222100；

2.第二军医大学附属长海医院消化内科，上海200043

胰腺癌是消化系统恶性程度极高的肿瘤之一，由于其侵袭性强并易发生早期转移，多数患者明确诊断时已属于晚期，预后很差。因此，明确其侵袭和转移的相关机制，寻找新的诊治靶点，是当前胰腺癌研究的重要课题。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4，TLR4)是最早发现的，也是研究最为广泛的Toll样受体家族成员。研究已证实，TLR4在多种肿瘤细胞中呈高表达，参与了肿瘤的发生、发展［1］。体外研究表明，TLR4在其外源性配体脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)的刺激下，可诱导肿瘤细胞分泌多种细胞因子和炎症介质，在促进肿瘤的侵袭和转移中具有重要的作用［2］。但目前关于TLR4在胰腺癌侵袭和转移中的作用尚研究较少，其相关机制有待于进一步明确。本研究通过免疫组化的方法，检测胰腺癌组织的TLR4、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase -9，MMP-9)蛋白表达情况，分析TLR4蛋白表达与胰腺癌主要临床病理参数以及MMP-9蛋白表达的关系；以LPS作用于体外培养的人胰腺癌细胞株PANC-1，观察其侵袭力和MMP-9蛋白表达的变化，初步探讨TLR4在胰腺癌侵袭和转移中的作用及其相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例标本

收集2007年1月—2010年12月长海医院手术切除并经病理证实的胰腺导管腺癌石蜡标本59例，所有标本临床和病理资料完整。其中男性40例，女性19例；年龄32～76岁，中位年龄62岁；肿瘤位于胰头38例，胰体尾21例；分化程度为高分化8例，中度分化23例，低分化28例；有淋巴结转移37例，无淋巴结转移22例；肿瘤直径≤3 cm者26例，>3 cm者33例。按照2002年国际抗癌协会(UICC)制定的TNM临床分期标准：Ⅰ期6例，Ⅱ期19例，Ⅲ期29例，Ⅳ期5例。所有患者手术前均无化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗。另外，随机选择30例癌旁距肿瘤5 cm以上且经病理证实为正常胰腺组织的标本作为对照。

1.1.2 细胞株

TLR4组成性高表达的人结肠癌细胞株HT-29购自中国科学院细胞库，人胰腺癌细胞株PANC-1购自美国ATCC公司。HT-29细胞在含有10% FBS的RPMI-1640的培养液，PANC-1在含有10% FBS的DMEM培养液中，37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养，培养液中含青霉素、链霉素，浓度均为100 U/mL。

1.1.3 主要试剂

兔抗人TLR4多克隆抗体、山羊抗人MMP-9多克隆抗体购自Santa Cruz公司。免疫组化SP试剂盒、 DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司。逆转录试剂盒和Real-time PCR试剂盒均为TaKaRa公司产品。Transwell小室购自Coster公司，Matrigel购自BD公司。 LPS为Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色

采用免疫组织化染色超敏两步法(SP染色法)检测正常胰腺组织和胰腺癌组织中TLR4、MMP-9蛋白表达，具体操作步骤按SP免疫组化试剂盒说明书进行。用已知TLR4、MMP-9蛋白表达强阳性的结肠癌组织切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。TLR4、MMP-9蛋白阳性染色为细胞膜和(或)细胞质出现棕黄色颗粒，随机观察5个不同高倍视野(×400)，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞率分别记分进行半定量结果判断［3］。阳性细胞率≤5%为0分，6%～29%为1分，30%～49%为2分，≥50%为3分；细胞无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据两项积分将TLR4、MMP-9蛋白表达分为：0分和1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3分和4分为中等强度阳性(+ +)，5分及以上者为强阳性(+ + +)。阳性表达率以表达阳性(包括弱阳性、中等阳性和强阳性之和)的病例占总病例数的百分比表示。

1.2.2 蛋白质印迹法(Western blot)检测TLR4、MMP-9蛋白表达

收集正常培养的HT-29、PANC-1细胞，提取细胞总蛋白，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移2 h后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人TLR4多克隆抗体，4 ℃温育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗，室温轻摇2 h，洗膜，加入增强化学发光(ECL)反应液，暗室显影、定影。以1 μg/mL的LPS分别作用于PANC-1细胞0、3、6、12和24 h，收集各组细胞，提取细胞总蛋白，进行MMP-9蛋白表达的检测。结果用凝胶图像软件分析系统对胶片扫描，与内参照β-actin进行比较，计算其比值。

1.2.3 Transwell小室检测细胞侵袭力

以1 μg/mL的LPS作用于PANC-1细胞24 h，同时以正常培养的PANC-1细胞作为对照。收集两组培养的细胞，用无血清的DMEM培养液制备成5×105/mL细胞悬液。用无血清DMEM培养液将Matrigel稀释，每个Transwell小室加入50 μL。待Matrigel充分聚合后，Transwell小室加入600 μL含10% FBS的DMEM培养液。取200 μL细胞悬液，接种至Transwell上室，常规培养24 h。取出Transwell小室，用棉签拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，PBS轻轻冲洗，晾干，然后用0.1%结晶紫染色10 min，去除多余结晶紫染液，普通光学显微镜下观察。每个样本随机选取4个200倍视野，计数穿膜细胞数并计算平均值，以穿膜细胞的数目表示肿瘤细胞的侵袭力。

1.3 统计学处理

所有数据均用SPSS 11.0统计软件包进行分析，计量资料以表示。计数资料采用χ2检验；计量资料采用t检验与方差分析；相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TLR4、MMP-9蛋白在癌旁正常胰腺组织和胰腺癌组织中的表达

TLR4蛋白阳性染色位于细胞膜与细胞质，以细胞膜为主(图1A、1B)。癌旁正常胰腺组织TLR4蛋白表达阴性(-)25例、弱阳性(+)4例，阳性(++)1例，阳性表达率为16.7%；胰腺癌组织中TLR4蛋白表达阴性(-)16例、弱阳性(+)9例、中等强度阳性(++)22例、强阳性(+++)12例，阳性表达率为72.9%，两者阳性表达率相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。

MMP-9蛋白阳性染色位于细胞膜与细胞质，以细胞质为主(图1C、1D)。癌旁正常胰腺组织MMP-9蛋白表达阴性(-)26例、弱阳性(+)4例，阳性表达率为13.3%；胰腺癌组织中MMP-9蛋白表达阴性(-)18例、弱阳性(+)9例、中等强度阳性(++)20例、强阳性(+++)12例，阳性表达率为69.5%，两者阳性表达率相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 TLR4、MMP-9蛋白表达与胰腺癌临床病理参数的关系

TLR4蛋白表达与胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤的部位、直径及分化程度无关。伴有淋巴结转移的胰腺癌组织中TLR4蛋白阳性表达率为83.8%，显著高于无淋巴结转移的54.5%(P<0.05)；TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期的胰腺癌组织中TLR4蛋白阳性表达率为85.3%，与Ⅰ+Ⅱ期的56.0%相比，差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-9蛋白表达与胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤的部位、直径无关，而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05，表1)。

表 1 TLR4、MMP-9蛋白表达与胰腺癌临床病理参数的关系Tab.1 Relationship between TLR4, MMP-9 protein expressions and clinicopathologic parameters of pancreatic ductal adenocarcinoma

2.3 胰腺癌组织中TLR4、MMP-9蛋白表达的相关性

Spearman等级相关分析表明，胰腺癌组织中TLR4蛋白表达与MMP-9蛋白表达呈显著正相关(r=0.384，P=0.003；图2)。

2.4 PANC-1细胞TLR4蛋白表达情况

与HT-29细胞相比，PANC-1细胞TLR4蛋白呈高表达(图3)。

2.5 LPS对PANC-1细胞侵袭力的影响

侵袭实验表明，LPS组的侵袭细胞数目为96.7±9.7，显著高于正常组的54.7±6.3(P<0.01，图4)。

2.6 LPS对PANC-1细胞MMP-9蛋白表达的影响

经LPS作用6、12、24 h后，PANC-1细胞MMP-9蛋白的相对表达量分别为0.65±0.09、0.67±0.10和0.55±0.09，均显著高于正常组的0.32±0.05(P<0.01，图5)。

3 讨 论

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是学者们在研究果蝇胚胎发育过程中发现的dToll 基因所编码的一种穿膜受体蛋白， 随后在人类细胞表面鉴定出与其同源的Toll样蛋白，并命名为TLR，即TLR4。TLR4主要表达于巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞及自然杀伤细胞等免疫细胞表面，在机体的天然免疫过程中发挥重要的作用［4］。近年来研究发现，TLR4除了在免疫细胞表达外，还在肿瘤细胞呈高表达，与多种肿瘤的发生、发展密切相关［5-7］。Sheyhidin等［8］通过RT-PCR和免疫组化的方法检测了87例食管鳞癌组织及相应癌旁组织中TLR4的表达情况，结果显示，TLR4在食管鳞癌组织中呈高表达，且与肿瘤的淋巴结转移以及浸润深度有关。Wang等［9］的研究结果表明，TLR4在结肠癌组织中呈高表达，且与肝转移及肿瘤的TNM分期密切相关。本研究也发现，在胰腺癌组织中，TLR4蛋白表达显著高于正常胰腺组织，且与胰腺癌的TNM分期以及淋巴结转移密切相关；TLR4蛋白在胰腺癌细胞株PANC-1中呈高表达，经LPS刺激后，PANC-1细胞的侵袭力显著增加。提示TLR4与胰腺癌的发生有关，且在促进胰腺癌侵袭和转移中起着重要的作用。

关于TLR4促进肿瘤侵袭和转移的分子机制，目前尚未完全阐明。研究表明，肿瘤的侵袭和转移是一个多阶段、多因素参与的复杂过程，细胞外基质和基底膜的降解是其中的关键步骤。MMP-9可降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质，使肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，最终导致肿瘤的侵袭和转移。大量的研究已证实，MMP-9在包括胰腺癌在内的多种肿瘤细胞中呈高表达，在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起到了重要的作用［10-12］。本研究结果也显示，在胰腺癌组织中，MMP-9蛋白呈高表达，且与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移以及TNM分期密切相关。经LPS刺激后，PANC-1细胞在侵袭力增加的同时，MMP-9蛋白表达显著上调，表明MMP-9是TLR4促进胰腺癌侵袭和转移中重要的下游蛋白。Xu等［6］通过对肺癌的研究也发现，TLR4的激活，可诱导MMP-9表达，从而促进肺癌细胞的侵袭。

总之，本研究结果表明，TLR4蛋白的高表达在胰腺癌侵袭和转移中起着重要的作用，其机制可能与促进MMP-9蛋白表达有关。但胰腺癌的侵袭和转移涉及多方面的复杂因素，TLR4蛋白的异常表达可能只是其中的一种形式，其确切的分子机制有待于进一步研究。

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