张利国 ,宋宪友*,房郁妍,郑楠 ,吴广文,

（黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086）

大麻是一种古老的栽培作物，有重要的工业、农用及药用价值，特别在纺织业和建筑业上，具有其它作物所不可替代的独特优势[1]，现已成为许多国家着力发展的重要经济作物。

多年来国内大麻育种研究工作主要集中在如何提高出麻率方面,而大麻经长期的异花授粉导致遗传背景非常复杂，遗传学与分子生物学的基础研究比较少，在改良纤维品质上的研究十分薄弱，一些问题难以通过传统的育种方法加以解决，比如改变不同类型木质素的比例、使之更易去除，基因工程等现代生物技术是解决这些问题的高效工具[2]。大麻 (Cannabis sativa L.),属大麻科(Cannabaceae)，其再生体系与亚麻等其它麻类相比应存在一定的特异性，良好的大麻再生体系对大麻的遗传转化、单倍体培养等具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料：龙大麻一号

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒

选取成熟的大麻新种子，用70%的乙醇消毒0.5～1.0min，无菌水冲洗 3～4遍；再用10%的 Na－ClO浸泡8～24 min，无菌水冲洗 4～5遍，然后在无菌条件下浸种 16～24 h，种皮吸水胀裂后，接种于 1/2MS培养基上，在24±1℃、光强 1800～2300 lx、16 h光照/8 h黑暗条件下培养待用。

1.2.2 愈伤组织的诱导及芽的分化

切取7～19 d的大麻无菌苗下胚轴，接种于不同激素组合的愈伤组织诱导及分化培养基上，诱导愈伤组织形成及芽的分化。每个培养皿接种约4-8个外植体，2次重复，培养条件与无菌苗的获得一致，继代频率为每周1次。为了选择最佳的ZT浓度，进行了ZT的浓度梯度试验（0、0.6、1.1、2.0、5.0 mg·L-1），配合以 0.2mg/l的 IAA。

愈伤组织诱导及芽分化培养基（所有培养基琼脂 0.8%，3%蔗糖，pH 5.8）：（1）MS+IAA1.1 mg·L-1+ZT 1.1mg·L-1；（2）MS+IAA0.2 mg·L-1+ZT 1.1 mg·L-1；（3）MS+IAA0.2 mg·L-1+ZT 2.0 mg·L-1；（4）MS+IAA 0.2mg·L-1+ZT 5.0 mg·L-1；（5）MS+IAA 0.2(1.1)mg·L-1+ZT0.6mg·L-1；（6）MS+IAA 0.2 mg·L-1+BA 2.0 mg·L-1。1.2.3 生根培养

将胚轴上形成的多个不定芽从基部切下，接种到不同的生根培养基当中。培养基为1/2MS培养基，分别加入 0.015、0.05、0.1、0.15、0.2mg·L-1的 IAA、NAA 和 IBA。

2 结果与分析

2.1 不同的消毒时间对组织培养的影响

研究采用10%次氯酸钠作为消毒剂。发现10%的次氯酸钠消毒18min以上杀菌效果较好，消毒18min、21min、24min，发芽率分别为91%、87%、82%，但21min、24min无菌苗的生理状态不佳（见表1），对以下的组织培养及转化工作不利，因此选择10%的次氯酸钠消毒18min，以减少消毒剂对种子的毒害。

表1 次氯酸钠处理对种子发芽的影响Tab.1 Effects of different NaClO concentrations and time on germinating seeds

2.2 ZT浓度对下胚轴不定芽诱导的影响

对于大麻的愈伤和不定芽诱导来说，ZT是一种十分有效的分裂素。它的诱导率可达到BA的2-3倍，为了选择最佳的ZT浓度，进行了ZT的浓度梯度试验，配合以0.2mg/l的IAA。由图1可以看出，随着ZT浓度的升高，不定芽诱导率逐渐升高，0.6mg/LZT的不定芽诱导率最高，可达57.70%，ZT浓度继续升高，不定芽诱导率逐渐降低。

2.3 苗龄对离体培养再生的影响

大麻下胚轴放在适合的愈伤诱导分化培养基（见后）上培养后，两边切口处渐渐膨大，形成愈伤组织（图2），在愈伤组织不断生长的同时，其表面逐渐变为淡绿色，同时出现绿色芽点，芽点不断生长，形成不定芽（图3）。在同一培养条件下，苗龄不同，形成愈伤组织和不定芽的状况也不同。对7天、10天、13天、16天、19天的苗龄进行对比试验，发现7天苗龄植株由于外植体相对比较幼嫩，愈伤形成率很低，仅为8.21%；19天苗龄外植体生长缓慢，愈伤形成率及芽分化率大大降低，下胚轴的芽分化率为27.39%。13天苗龄的下胚轴分化率最高，可达58.17%，10天和16天苗龄的外植体分化率较高，9天苗龄下胚轴分化率为45.22%，16天苗龄下胚轴分化率为50.75%。因此，选择适当苗龄的外植体是获得高频率离体再生的基础。

图1 ZT浓度对下胚轴不定芽诱导的影响Fig.1 Effect of ZT concentrations on inducing adventitious shoots of hypocotyl

2.4 不同激素组合对愈伤诱导和不定芽伸长的影响

图2 愈伤的逐渐膨大Fig.2 Swollen calli

图3 愈伤和不定芽的诱导Fig.3 Inducted calli and adventitious shoots

图4 不定芽的伸长Fig.4 Elongated adventitious shoots

不同激素组合及浓度都会影响愈伤形成及芽分化。本试验使用了BA、ZT两种激动素和不同浓度的IAA组合，发现愈伤诱导及芽分化率有很大不同。BA、ZT和IAA的组合，均能诱导大麻外植体的分化，其中ZT 1.1mg/l和IAA 1.1mg/l的组合对愈伤诱导效果最好，下胚轴的出愈率能达到87%，当ZT浓度大于1.1mg/l时，随着ZT浓度的升高，不定芽诱导率逐渐降低。以ZT 0.6mg/l和IAA 1.1mg/l的组合对芽的伸长相对效果较好,芽的分化率可达61.32%（表2）。

表2 不同激素组合对下胚轴愈伤诱导和芽分化率的影响Tab.2 Effects of different hormones on the frequencies of calli induction and bud differentiation

2.5 不同生长素种类及浓度对生根的影响

分化出的芽长至2-3cm时（图4），将外植体上形成的多个不定芽从基部切下，插入不同的生根培养基中。研究发现，1/2MS培养基及加入低浓度生长素的1/2MS培养基，生根效果较好。IAA、IBA、NAA三种激素对生根的影响差别较大（图5）。较低浓度的IAA和IBA生根能力明显强于NAA(图 6)。

图5 不同激素及其浓度对生根的影响Fig.5 Effect of different hormones and concentrations on rooting

图6 不定芽的生根Fig.6 Rootings of adventitious shoot

3 结果与讨论

次氯酸钠会影响植物幼苗的生长[3]，还可能促进体细胞胚胎的发生[4]，因此，在选择消毒时间时，应当考虑消毒剂的生理影响。综合考虑，大麻的种子消毒较优化条件为，70%酒精消毒1min，10%的次氯酸钠消毒18min。

由于大麻种皮较厚，消毒后不易萌发，因此，消毒后选择无菌条件下浸种16～24 h，种皮破裂露白后再接种于1/2MS培养基上，取得了较好效果。此外发现，使用当年的新种子在同一条件下消毒效果好，如果是陈种子应当在晒干后，适当延长消毒时间与增加消毒剂浓度。对龙大麻一号来说，消毒21分钟以上，虽然灭菌效果和清除残留物效果较好，但会出现幼苗的异常生长，因而在选择消毒时间时，还应当注意消毒剂的生理影响。

龙大麻一号适合的再生条件为，1.1mg/L ZT和IAA 1.1mg/l的愈伤及芽的诱导率最高，采用13天苗龄的下胚轴、试验设计中ZT0.6mg/l和IAA 1.1mg/l的组合较适合不定芽的伸长，低浓度的IAA和IBA生根能力均较强，0.05%IAA生根能力最好。

[1] 张利国.大麻三个农家品种的核型分析与比较研究[J].中国麻业，2009，31（1）：11.

[2] 关凤芝.大麻遗传育种与栽培技术[M].哈尔滨：黑龙江人民出版社，2010.

[3] Inouhe M,Nevius D J.Auxin-enchanced glucan autohydrolysis in maize coleoptile cell walls[J].Plant Physiol,1991,96(1):285.

[4] Goudey J S,Tittle F L,Spencer M S.Effects of hypochlirite disin-fection on the response of barley alourone layer to gibberellic acid[J].Pysiol Plant,1987,69(2):295.