魏建层，赵 珊，苏五缺，齐晓光

（1.河北省石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司质量管理部，河北石家庄 050035；2.河北省制剂工程技术研究中心，河北石家庄 050035）

注射用盐酸头孢唑兰无菌检查法验证

魏建层1，2，赵 珊1，2，苏五缺1，2，齐晓光1，2

（1.河北省石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司质量管理部，河北石家庄 050035；2.河北省制剂工程技术研究中心，河北石家庄 050035）

目的建立注射用盐酸头孢唑兰的无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。方法按中国药典2010年版二部（附录ⅪH）无菌检查法，采用酶中和结合薄膜过滤法消除头孢唑兰的抑菌活性。结果注射用盐酸头孢唑兰的抑菌活性被消除。样品管无菌生长，六株阳性对照菌生长良好。结论酶中和薄膜过滤法可作为注射用盐酸头孢唑兰无菌检查的常规方法。

盐酸头孢唑兰；薄膜过滤法；研究

注射用盐酸头孢唑兰属第四代广谱头孢类抗生素，对革兰阳性菌及革兰阴性菌均具有广谱抗菌作用［1］，注射用盐酸头孢唑兰是盐酸头孢唑兰加适量无水碳酸钠和氯化钠制成的无菌冻干品［2］，为了确保临床用药安全，注射剂类必须进行无菌检查［3］。本试验旨在进行注射用盐酸头孢唑兰无菌检查时选择适宜的方法消除其抗菌作用，建立并验证注射用盐酸头孢唑兰无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。根据盐酸头孢唑兰分子结构中含有β-内酰胺环的特点，本试验采用头孢菌素酶来水解β-内酰胺环的酰胺键，使其失去抗菌活性，并结合薄膜过滤法来建立注射用盐酸头孢唑兰的无菌检查方法［4-6］。

1 仪器与材料

1.1 仪器：HTY-Ⅲ（A）型智能集菌仪、HTY-K型培养器专用振荡仪及全封闭式无菌过滤培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）。

1.2 供试品：注射用盐酸头孢唑兰（石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，1.0g/支，批号110801、110802、110803）。

1.3 培养基及冲洗液：硫乙醇酸盐流体培养基（批号101125）、改良马丁培养基（批号101002）、营养肉汤培养基（批号100422）、营养琼脂培养基（批号1007298）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号 00816）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号100712），均由北京三药科技开发公司提供。

1.4 验证试验用菌种：①金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；②大肠埃希菌［CMCC（B）44102］；③铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］；④枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］；⑤生孢梭菌［CMCC（B）64941］；⑥白色念珠菌［CMCC（F）98001］；⑦黑曲霉［CMCC（F）98003］。以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

按中国药典2010年版二部无菌检查法（附录ⅪH）方法验证进行试验［3］。

2.1 菌液制备

2.1.1 细菌菌悬液制备：取经33℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1mL加9mL 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-6，含菌数＜100cfu/mL，作活菌计数备用。

2.1.2 生孢梭菌菌液制备：取经33℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1mL加9mL 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-7，含菌数＜100cfu/mL，作活菌计数备用。

2.1.3 白色念珠菌菌液制备：取经25℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1mL加9mL 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5，含菌数＜100cfu/mL，作活菌计数备用。

2.1.4 黑曲霉孢子悬液制备：取经25℃培养5～7d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管中，然后取1mL加9mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释为10-5，含孢子数＜100cfu/mL，作活菌计数备用。

2.2 菌液计数：每种菌液做平行2皿。加入上述5种细菌菌液各1mL，注入营养琼脂约15～20mL，待凝后，33℃倒置培养（生孢梭菌注入100mL硫乙醇酸盐液体培养基），48h培养后计数。取白色念珠菌悬液、黑曲霉菌悬液各1mL，分别注入玫瑰红钠琼脂培养基15～20mL，25℃培养，72h培养后计数。活菌计数结果见表1。

表1 活菌计数Table 1 The result of viable count（cfu/mL）

2.3 培养基适用性检查［7］

2.3.1 培养基无菌检查：分别取同批配制的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基5支，置规定温度下培养14d，均无菌生长。

2.3.2 培养基灵敏度检查：取每管装量为12mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种＜100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作为空白对照，培养3d；取每管装量为9mL的改良马丁培养基5支，分别接种＜100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5d。逐日观察结果。结果表明，空白对照管无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，培养基的灵敏度检查符合规定。见表2。

表2 培养基灵敏度检查结果Table 2 The result of medium sensitivity test

2.4 验证方法

2.4.1 预试验：取供试品10支，按薄膜过滤法过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次，每次100mL，在最后一次的冲洗液中逐一加入＜100cfu的试验菌1mL，将含有头孢菌素酶2mL（＞20万U/mL）的100mL硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基注入集菌培养器一罐体内，作为预试验组；另取等量试验菌，不加样品重复操作，作为阳性对照组；分别置33℃培养3d和25℃培养5d，逐日观察。预试验结果表明，注射用盐酸头孢唑兰对于金黄色葡萄球菌较为敏感，故将金黄色葡萄球菌作为样品无菌检查时的阳性对照菌，考虑到冲洗量已足够大，为避免滤膜上的微生物受损，没有进一步增大冲洗量，而后采取增加头孢菌素酶量进行验证。见表3。

表3 预试验结果Table 3 The result of pre-experiment

2.4.2 阳性菌试验：增加培养基中头孢菌素酶的含量，每100mL硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中加入4mL头孢菌素酶（＞40万U/mL），操作方法同2.4.1进行试验。当培养基中加入4mL头孢菌素酶（＞40万U/mL）后，冲洗量为800mL时，金黄色葡萄球菌生长良好。见表4。

表4 阳性菌试验结果Table 4 The result of positive bacteria test

2.5 平行试验：取3批样品各10支，按薄膜过滤法过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次，每次100mL，在最后一次的冲洗液中逐一加入＜100cfu的试验菌1mL，将含有头孢菌素酶4mL（＞40万U/mL）的100mL硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基注入集菌培养器一罐体内，作为预试验组；另取等量试验菌，不加样品重复操作，作为阳性对照组；分别置33℃培养3d和25℃培养5d。结果表明，六株试验菌均生长良好，注射用盐酸头孢唑兰在此检验条件下无抑菌作用。见表5。

表5 三批样品平行试验结果Table 5 The result of the three batches of samples in parallel test

2.6 样品无菌检查：取本品30支按薄膜过滤法滤至一次性全封闭式无菌过滤培养器（三联）中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次，每次100mL，2个滤筒加入含4mL头孢菌素酶（ ＞40万U/mL）的硫乙醇酸盐流体培养基（其中一个滤筒接入1mL＜100cfu的金黄色葡萄球菌作为阳性对照），第3个滤筒加入改良马丁培养基，按规定温度培养14d，逐日观察。培养14d后供试品均澄清，阳性对照生长良好，供试品符合规定。

3 讨 论

根据《中国药典》2010年版附录的要求，注射剂必须进行无菌检查，其目的是既要保证标准规定的所有阳性对照菌正常生长，又要准确无误地检查样品染菌情况，因此对其进行验证是十分必要的。对于有抗菌活性的品种用薄膜过滤法进行无菌检查，且要消除其抑菌活性，可行的办法有增大稀释剂体积及冲洗液用量、使用中和剂、选取合适的稀释剂和冲洗液种类、选取适合于抗生素的滤膜等途径［3，8］。

本试验结果显示金黄色葡萄球菌对盐酸头孢唑兰最敏感，在培养基中加入20万U/mL头孢菌素酶，冲洗量为800mL时，出现抑菌现象。由于冲洗量已足够大，若再通过增加冲洗量一般也不能有效去除抑菌活性，故在此冲洗量下增加了头孢菌素酶的用量［9-10］。当增加酶用量后，金黄色葡萄球菌生长良好，说明对于头孢类抗生素在进行无菌检查时，可在样品溶液、培养基或冲洗液中加入头孢菌素酶消除样品干扰［11］。考虑到降低试验成本，故本试验将头孢菌素酶加入培养基中，而不是样品溶液或冲洗液中，在节省加酶量的同时还能使酶与残留药物反应更加完全［12］。经过3次验证试验，与阳性对照组比较，含供试品的各滤筒中的试验菌均生长良好，并与各对照组中相应菌落生长情况相似。由此说明，在此检验条件下无抑菌作用，故可作为注射用盐酸头孢唑兰的无菌检查法。

此外，试验的冲洗过程中要不时振摇，以将集菌培养器顶部残留的头孢唑兰冲洗干净，保证冲洗效果。

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（本文编辑：赵丽洁）

VALIDATION OF METHOD FOR STERILE EXAMINATION OF CEFOZOPRAN HYDROCHLORIDE FOR INJECTION

WEI Jianceng1，2，zHAO Shan1，2，SU Wuque1，2，QI Xiaoguang1，2
（1.Department of Quality Management，Hebei CSPC ZhongQi Pharmaceutical Technology（Sjz）Co.，Ltd，Shijiazhuang 050035，China；2.Hebei Province Pharmaceutical Engineering Technology Research Center，Shijiazhuang 050035，China）

ObjectiveTo establish a sterility test of cefozopran hydrochloride for injection and to ensure the accuracy and reliability of test results.MethodsAccording to the China Pharmacopoeia（2010 edition），the antibacterial activity of cefozopran hydrochloride was eliminated with the ways of enzyme neutralization and membrane filtration.ResultsThe results showed no bacterial growth in the test tube and six strains of positive bacteria grew well.ConclusionThe method is viable for the sterility test of cefozopran hydrochloride for injection.

cefozopran hydrochloride；membrane filtration method；research

R927.11

A

1007-3205（2012）11-1286-04

2012-04-24；

2012-07-09

科技部“十一五”重大新药创制（2011zX09401-306）

魏建层（1972-），男，河北石家庄人，石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司医药工程师，医学学士，从事药物生产研发质量管理。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.019