孙绪丁 刘玉芹 任松鹏 李 丽

HPLC法测定青鹏软膏中亚大黄的含量

孙绪丁 刘玉芹 任松鹏 李 丽

目的建立藏药青鹏软膏中亚大黄的三种蒽醌类成分大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的高效液相色谱法（HPLC）含量测定方法。方法Waters C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（87:13）；流速为1.0ml/min，检测波长 430nm，柱温为室温。结果大黄素在 3.24μg/ml～32.4μg/ml，大黄酚在 3.36μg/ml～33.6μg/ml，大黄素甲醚1.78μg/ml～17.8μg/ml浓度范围内均与色谱峰峰面积呈良好的线性关系，相关系数r分别为0.9996、0.9998、0.9991；大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率分别为 98.87%、98.12%、97.67%，RSD分别为 1.57%(n=6)、1.81%(n=6)、1.24%(n=6)。结论本方法可同时测定制剂中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，可用于青鹏软膏的质量控制。

青鹏软膏；大黄素；大黄酚；大黄素甲醚；HPLC；含量测定

青鹏软膏由棘豆、亚大黄、铁棒锤、诃子（去核）、毛诃子、余甘子、安息香、宽筋藤、人工麝香等九味藏药制成的藏药成方制剂，具有止痛消肿的作用，用于痛风、湿痹、“冈巴”、“黄水”病等引起的肿痛发热、疱疹、瘟疠发烧等。亚大黄为该制剂处方中的君药，其含有的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等蒽醌类成分具有很强的药理活性[1]，因此对方中亚大黄的蒽醌成分的控制变得尤为重要。现行标准[2]没有对亚大黄中的蒽醌类成分进行含量测定，文献也尚未见关于青鹏软膏亚大黄中的蒽醌成分HPLC法含量测定的报道。为了有效控制该制剂的质量，本文首次建立了青鹏软膏中亚大黄的三种蒽醌类成分大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的 HPLC含量测定方法，方法学考察结果表明，该方法具有分离效果好、灵敏度高、准确可靠等优点，能够更加有效的控制青鹏软膏的质量。

1 仪器与试药

L-2100型日立高效液相色谱仪（日立公司），

包括日立L-2100泵，日立L-2400紫外检测器；岛津 AUW220D电子天平（岛津公司）；KQ-300B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州荣冠实验仪器分析厂）。

大黄素对照品（批号为 110756-200100，供含量测定用）、大黄酚对照品（批号为110796-201017，供含量测定用）、大黄素甲醚对照品（批号为110758-201013，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所；青鹏软膏（青海金诃藏药药业股份有限公司），生产批号分别为20110512、20110513、20110514；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1样品溶液制备

2.1.1混合对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含大黄素对照品、大黄酚对照品各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液，分别精密量取上述对照品溶液各2ml，至10ml容量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，混匀，即得（即每1ml中含大黄素、大黄酚各16μg，含大黄素甲醚8μg）。

2.1.2供试品溶液的制备取青鹏软膏3g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声 40min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加体积百分比为8%盐酸溶液10ml，超声2min，再加三氯甲烷10ml，加热回流1h，放冷，置分液漏斗内，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶液至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3阴性对照溶液的制备取处方组成中除亚大黄外的其余成分按制剂工艺制成不含亚大黄的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法同法处理得阴性对照溶液。

2.2色谱条件及系统适应性试验色谱柱为Waters C18柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（87:13），流速为 1.0ml/min，检测波长430nm，柱温为室温；分别取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于 3000；拖尾因子在0.95～1.05，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚保留时间分别约为 7.6min、10.6min、14.3min，三种成分与其它组分的分离度均＞1.5；阴性对照样品不干扰样品测定，结果见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3线性关系考察精密量取对照品贮备液（大黄素含量为32.4μg/ml、大黄酚含量为33.6μg/ml，大黄素甲醚含量为17.8μg/ml）1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分别置 10ml容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，各精密进样10μl，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，以色谱峰峰面积（A）对对照品浓度（C）进行线性回归。试验结果：大黄素的回归方程为 A=10637C－8283.7，相关系数r=0.9996，线性范围为3.24μg/ml～32.4μg/ml；大黄酚的回归方程为 A=13835C－8284.0，相关系数r=0.9998，线性范围为3.36μg/ml～33.6μg/ml；大黄素甲醚的回归方程为 A=5017.5C－2270.8，相关系数r=0.9991，线性范围为1.78μg/ml～17.8μg/ml。结果表明：大黄素、大黄酚、大黄素甲醚三种成分分别在3.24μg/ml～32.4μg/ml、3.36μg/ml～33.6μg/ml、1.78μg/ml～17.8μg/ml浓度范围内与色谱峰峰面积线性关系良好。

2.4精密度试验精密吸取浓度为 16.2μg/ml、16.8μg/ml、8.9μg/ml的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚混合对照品溶液 10μl，注入液相色谱仪，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，连续测定6次，记录色谱峰峰面积并计算相对标准偏差RSD。试验结果：大黄素对照品色谱峰峰面积的平均值为168536，RSD=1.025%；大黄酚对照品色谱峰峰面积的平均值为226015，RSD=0.93%；大黄素甲醚对照品色谱峰峰面积的平均值为39758，RSD=1.67%。结果表明仪器精密度良好。

2.5稳定性试验精密称取青鹏软膏样品（批号为20110512）按照“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，取供试品溶液，精密吸取 10μl，注入液相色谱仪，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，以后每隔2h测定一次，考察8h，计算峰面积的相对标准偏差 RSD。试验结果：供试品溶液中，大黄素色谱峰峰面积的平均值为53844，RSD=0.65%；大黄酚色谱峰峰面积的平均值为57074，RSD=1.47%；大黄素甲醚色谱峰峰面积的平均值为 13742，RSD=1.22%。结果表明：供试品溶液中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在8h内测定结果稳定。

2.6重复性试验精密称取同一批青鹏软膏样品（批号为20110512）6份，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，计算样品中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量及其相对标准偏差RSD。试验结果：样品中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量平均值分别为0.120mg/g、0.115mg/g、0.062mg/g，RSD分别为1.76%、1.52%、1.28%。结果表明：该分析方法重复性良好。

2.7加样回收率试验分别精密称取已知含量的青鹏软膏样品（批号为20110512，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为 0.120mg/g、0.115mg/g、0.062mg/g）6份，置具塞的锥形瓶中，各精密加入混合对照品溶液（大黄素含量为16.2μg/ml、大黄酚含量为 16.8μg/ml，大黄素甲醚含量为 8.9μg/ml）10ml和甲醇 40ml，按“2.1.2”项下的供试品制备方法制成供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，计算回收率及其相对标准偏差RSD。试验结果：供试品中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率分别为98.87%、98.12%、97.67%，RSD分别为1.57%、1.81%、1.24%。结果表明该测定方法测定结果准确（见表1、2、3）。

表1 大黄素加样回收率试验结果(n=6)

表2 大黄酚加样回收率试验结果(n=6)

表3 大黄素甲醚加样回收率试验结果(n=6)

2.8样品含量测定取青鹏软膏三批样品，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液（大黄素含量为16.2μg/ml，大黄酚含量为16.8μg/ml，大黄素甲醚含量为8.9μg/ml）和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法分别计算供试品中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，结果见表4。

表4 三批样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

参考蒽醌类成分含量测定文献，无法实现同时测定青鹏软膏中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。于是取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品混合溶液，于190～500nm波长范围内进行紫外扫描，结果表明混合对照在430nm波长处有较大吸收，根据紫外吸收图谱选定430nm为本实验的检测波长，结果发现青鹏软膏中亚大黄的三种蒽醌类成分均得到很好的色谱分离，且在此波长下检出杂质较少。

大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等蒽醌类成分是亚大黄的主要活性成分，根据蒽醌类化合物的性质，参考相关文献，试验中以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为考察指标，对供试品溶液的制备进行了方法学研究：考察了不同提取溶剂乙醇、甲醇、三氯甲烷，不同提取方法超声与加热回流，不同提取时间30min、40min、50min，不同萃取溶剂乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷的提取效率。结果显示，采用甲醇超声提取 40min，酸水溶解后三氯甲烷萃取能够将青鹏软膏中亚大黄的三种蒽醌类成分大黄素、大黄酚、大黄素甲醚提取完全。

目前文献中没有关于亚大黄中蒽醌类成分HPLC含量测定的报道。选择色谱条件时，参考HPLC法测定蒽醌类成分相关文献，选择甲醇-磷酸体系作为检测青鹏软膏中亚大黄的三种蒽醌类成分大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的流动相，而且甲醇-0.1%磷酸(70～90:10～30)均能达到含量检查要求，其中以甲醇-0.1%磷酸(87:13)条件下效果最好，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚保留时间分别约为7.6min、10.6min、14.3min，三种成分与其它组分分离度均大于1.5，峰形较好，可用青鹏软膏的质量控制。

[1]刘斌,巩鸿霞,肖学凤,等.决明子化学成分及药理作用研究进展[J].药物评价研究,2010,33(4):312-315.

[2]傅兴圣,陈菲,刘训红,等.大黄化学成分与药理作用研究新进展[J].中国新药杂志,2011,20(16):1534-1538.

HPLC method for the determination of Qingpeng ointment of Rhubarb in Central Asia

Sun Xuding Liu Yuqin Ren Songpeng Li Li

ObjectiveTo establish Tibetan Qingpeng ointment in three of rhubarb anthraquinone ingredient emodin,chrysophanol physcion,high performance liquid chromatography ( HPLC ) content determination method.MethodsWaters C18 column ( 250mm ×4.6mm,5μm ),mobile phase of methanol -0.1% phosphoric acid ( 87∶13 ); the flow rate was 1.0ml/min,the detection wavelength was 430nm,column temperature was at room temperature.ResultsEmodin in 3.24μg/ml～32.4μg/ml,Chrysophanol in 3.36μg/ml～33.6μg/ml,physcion in 1.78μg/ml～17.8μg/ml concentration range and chromatographic peak area showed a good linear relationship,the correlation coefficient r are respectively 0.9996,0.9998,0.9991; emodin,chrysophanol emodin monomethyl ether,the average recoveries were 98.87%,98.12%,97.67%,RSD were 1.57% (n=6 ),1.81% (n=6 ),1.24% (n=6 ).ConclusionThis method can be simultaneously determined in preparation of emodin,chrysophanol,physcion,can be used for the quality control of Qingpeng ointment.

Qingpeng ointment; Emodin;Chrysophanol; Emodin monomethyl ether; HPLC; Content determination of

山东阿如拉药物研究开发有限公司，山东济南 250101