杨冰　刘忠民

[摘要] 目的 探讨抵抗素基因rs34861192单核苷酸多态性与2型糖尿病的关系。 方法 分别测定2型糖尿病组（T2DM组）100例及正常对照组（CON组）150例空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FIN）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-CH）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CH）和抵抗素，并计算胰岛素抵抗指数（IRI）；同时采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对T2DM组和CON组进行抵抗素rs34861192位点基因型的检测，根据结果进行综合分析。 结果 T2DM 患者FBG、FIN、IRI、TG、抵抗素的检测数值[分别为（9.96±5.86） mmol/mL，（12.23±9.21） μg/mL，6.25±4.13，（2.02±1.85） mmol/mL，（7.24±3.65） ng/mL]高于健康人群的检测数值[分别为（4.94±0.50） mmol/mL，（5.63±2.66） μg/mL，1.24±0.62，（1.33±0.74） mmol/mL，（1.44±0.93） ng/mL]，差异有统计学意义（t值 分别为8.535，4.586，4.936，3.516，15.524，P均<0.05）；T2DM组和CON组抵抗素rs34861192位点的基因型分布分别为AA6%、AG40%、GG54%和 AA 0.7%、AG20%、GG79.3%；抵抗素基因rs34861192位点的基因型分布和等位基因频率在T2DM组和CON组间有统计学意义（χ2值分别为20.231、19.103，P均<0.05）。 结论 抵抗素可能是T2DM的危险因子，抵抗素基因rs34861192位点多态性与2型糖尿病相关，同时可能对脂代谢有一定影响。

[关键词] 抵抗素；基因多态性；2型糖尿病

[中图分类号] R541[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）21-0048-04

人的抵抗素基因存在多种单核苷酸多态性（SNP）现象，而SNP与2型糖尿病间的相关性，目前并无统一定论，可能与研究样本的数量、病例及位点的选取有关，更可能与不同种族间的糖尿病易感性及个体差异有关。我们研究抵抗素水平和抵抗素基因rs34861192位点多态性与T2DM的关系，分析此抵抗素基因是否为2型糖尿病的易感基因，为2型糖尿病的早期预测、诊断、治疗及预后提供分子生物学依据。

1材料与方法

1.1材料

仪器与试剂 ① 实验仪器：质谱检测仪（MassARRAY Analyzer Compact），点样仪（MassARRAYNanodispenser），384 孔双头 PCR 仪（GeneAmp PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module），6mg 384纯化板（SEQUENOM 公司），STAR全自动样本工作站和FAME全自动酶标分析仪，罗氏cobase 411 全自动电化学发光免疫分析仪。 ② 主要试剂：通用基因组DNA提取试剂盒（广州市达晖生物技术有限公司），iPLEX PCR反应试剂盒（SEQUENOM 公司），384-well SpectroCHIP 生物芯片（SEQUENOM 公司），HOTSTART Taq酶（SEQUENOM 公司），虾碱性磷酸酶（SAP酶，SEQUENOM 公司），阳离子交换树脂（SEQUENOM 公司），阳性质控YH（深圳华大基因研究院培育的“炎黄一号”细胞株DNA），抵抗素（RapidBio Lab Calabasaa），胰岛素（Abbott Japan CO，LTD），葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯（中生北控生物科技股份有限公司），高密度脂蛋白胆固醇（日本第一化学药品株式会社），低密度脂蛋白胆固醇（DiaSys Diagnostie Systems GmbH，德赛）。

1.2 对象

（1）正常对照组（CON组）：健康体检的150例个体，无T2DM（均检测空腹及餐后2 h血糖），无冠心病（无主述史并且心电图无异常），体重指数（body mass index，BMI）<25kg/m2。（2）T2DM组：新诊断的T2DM患者100例（符合1999年WHO糖尿病诊断标准和亚太地区成人超重和（或）肥胖标准）：①糖尿病症状+任意时间血浆葡萄糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）；②空腹血浆葡萄糖（FPG）水平>7.0mmol/L（126 mg/dl）；③OGTT试验中，餐后2 h血糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）。未用过胰岛素，噻唑烷二酮类及其他口服降糖药物，并排除继发性2型糖尿病的可能。

1.3 方法

①样本采集所有受检者均隔夜空腹8 h以上，清晨抽静脉血8 mL，其中一支EDTA-K2抗凝血2 mL，充分摇匀，彻底抗凝，作抵抗素单核苷酸多态性之用。两支干燥管各注入3 mL血液，干燥管3 000 rpm/min离心15 min；一支分离血清，-20°C保存，用于抵抗素、胰岛素检测；另一支检测基础生化项目，包括空腹葡萄糖（FPG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-CH）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CH）。②基因分型按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。由广东省深圳市华大基因公司采用美国 SEQUENOM 公司的MassARRAY 时间飞行质谱技术（MALDI-TOF MS）完成对抵抗素SNP的基因分型。通过 PCR 扩增，SAP 酶处理，延伸引物单碱基延伸，树脂除盐纯化，芯片点样，质谱检测等实验步骤，最终使用 Typer 4.0 软件分析实验数据，获得基因分型结果。③抵抗素的检测 采用双抗体夹心ELISA法。实验仪器为STAR全自动样本工作站和FAME全自动酶标分析仪。④空腹胰岛素（fasting insulin，FIN）的检测 采用化学发光技术即化学发光微粒免疫分析。实验仪器为罗氏cobase 411 全自动电化学发光免疫分析仪。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），IRI=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。⑤其他生化指标的检测空腹葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法测定，总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇采用终点法测定，低密度脂蛋白胆固醇采用选择性抑制直接法测定。

1.4 统计学方法

数据处理采用SASS17.0分析软件分析。对每组数据进行正态性分析，FIN、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH、IRI和抵抗素以（x±s）表示，两组间变量比较采用独立样本t检验， P < 0.05为差异有统计学意义；变量之间相关关系分析先采用散点图分析，有相关关系的趋势变量再采用spearman进行相关分析；研究对象的基因型和等位基因频率直接计算，群体符合程度用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各组间基因型和等位基因频率比较采用卡方检验，各基因型相对指标的比较采用单因素ANOVA分析，方差不齐采用秩和检验。

2 结果

2.1 T2DM组与正常对照组的临床特征

CHOL、HDL-CH、LDL-CH采用t检验，FBG、FIN、IRI 、TG、抵抗素在两组间的差异性采用非参数秩和检验。结果发现，T2DM组与正常对照组的FBG、FIN、IRI、TG、HDL-CH及抵抗素差异有统计学意义（P ＜ 0.05），T2DM组的FBG、FIN、IRI、TG及抵抗素显著高于对照组，HDL-CH显著低于对照组，而两组的CHOL、LDL-CH差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。见表1。

2.2抵抗素基因rs34861192的单核苷酸多态性

AA基因型（图1），AG基因型（图2），GG基因型（图3）。

图1 AA基因型

图2 AG基因型

图3GG基因型

2.3抵抗素基因rs34861192基因型在两组人群中分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律

结果表明，本研究具有群体代表性。抵抗素基因rs34861192多态性的基因型频率在T2DM组和正常对照组中差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。两组间均以等位基因G为主，等位基因频率的分布在两组间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表2。

2.4 T2DM组抵抗素各基因型间各检测指标水平的比较

表3显示，FBG、FIN、IRI、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH及抵抗素在T2DM组内，rs34861192的不同基因型携带群体间差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。表4显示T2DM患者抵抗素rs34861192位点 AA型基因携带者与G等位基因携带者比较，两组的FBG、FIN、IRI、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH及抵抗素水平均无统计学意义（P ＞ 0.05）。抵抗素rs34861192GG型基因携带者CHOL、LDL-CH明显高于AG型基因携带者（P ＜ 0.05），见表5。

表5 T2DM组内各检测指标的水平在各基因型携带人群之间的比较

3讨论

抵抗素是一种由脂肪细胞分泌的新激素，由Steppan等[1]在研究抗糖尿病的新药胰岛素增敏剂噻唑烷二酮衍生物的作用机制过程中，在筛选小鼠体内诱导脂肪细胞分化基因时发现，因其与胰岛素抵抗有关而命名为抵抗素。大量文献报道，国外多数学者研究表明[1]，2型糖尿病患者有较高的抵抗素水平。近年来，国内学者研究抵抗素与2型糖尿病之间的关系比较活跃，大多侧重于临床研究，一部分研究者认为2型糖尿病患者血中抵抗素水平显著高于正常组。

本研究对100例2型糖尿病患者和150例健康对照者的血清进行相关临床参数测定后发现，2型糖尿病组与正常对照组间空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、抵抗素差异有统计学意义（P < 0．05），而两组的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇差异无有统计学意义（P > 0．05）。其中2型糖尿病组的空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、甘油三酯及抵抗素显著高于对照组，呈正相关，而高密度脂蛋白胆固醇呈负相关。本研究结果与黎银燕[2]、陈江[3]、郝小林[4]的报道一致，表明2型糖尿病的发生可能与抵抗素水平的增高有关，并且血清抵抗素与糖尿病患者的胰岛素抵抗指数呈正相关，提示可能是2型糖尿病患者体内增加的脂肪组织合成和分泌大量的抵抗素引起胰岛素抵抗，使血糖水平升高，而高血糖又通过诱导脂肪组织对抵抗素的高表达，进一步加重机体对胰岛素抵抗，从而最终导致糖尿病的发生。研究也证实抵抗素与血糖水平、甘油三酯和高密度脂蛋白相关，提示抵抗素不仅参与糖代谢还参与血脂代谢，可能抵抗素对能量代谢有更广泛的影响。所以，我们认为抵抗素参与了胰岛素抵抗过程和2型糖尿病的发病过程，并且与2型糖尿病密切相关。

抵抗素基因与T2DM的关系因多态性位点的部位和种类不同而有所不同，国内外学者对此也做了广泛研究，当前，抵抗素基因-420多态位点与+299多态位点研究较多。NCBI数据库上我们发现抵抗素基因rs34861192位点在国外人群中有一定突变率，而对于广州地区人群该基因位点多态性的相关研究未见文献报道。本研究检测了100例2型糖尿病患者和150例健康对照者的抵抗素基因rs34861192的三种基因型分布，结果发现该位点SNP存在G→A的突变而呈现三种基因型： AA型、 AG型和GG型，在T2DM组和CON组内该位点的基因型分布分别为AA6%、AG40%、GG54%和 AA 0.7%、 AG20%、GG79.3%，该位点的基因型频率在T2DM和正常对照组中差异有统计学意义（P < 0．05），并且等位基因频率的分布在两组间差异也有统计学意义（P < 0．05），提示抵抗素基因rs34861192多态性与T2DM发病有相关性，G等位基因可能通过活化抵抗素基因转录过程，增加抵抗素表达，降低胰岛素敏感性，直接参与胰岛素抵抗的发生。本研究还发现在T2DM组中，GG型基因携带者的CHOL、LDL-CH明显高于AG型基因携带者（P < 0．05），提示通过基因变异叠加作用，纯合子较杂合子的变异效能明显增强，对T2DM的发病可能具有更大意义，表明G等位基因参与胰岛素抵抗的发生，抵抗素基因rs34861192多态性可能对脂代谢有一定影响。

目前对于抵抗素是否联系糖尿病的主要因素尚有争议，其作用机制有待阐明，其研究还处于动物实验及体外试验阶段，存在大量问题有待于进一步的研究与探讨。

[参考文献]

[1]Steppan CM，Bailley ST，Bhats，et a1． The hormone resistin links obesity to diabetes[J]． Nature，2001，409（6818）：307-312．

[2]黎银燕，周强，罗淼珊，等． 2型糖尿病患者血清抵抗素的检测及其与胰岛素抵抗的关系[J]． 中华生物医学工程杂志，2008，14（2）：145-147．

[3]陈江，姜东林，曹利民． 2型糖尿病患者血浆抵抗素和游离脂肪酸与胰岛素抵抗关系研究[J]． 中国微循环，2006，10（1）：52-54．

[4]郝小林． 血清抵抗素与糖尿病的相关性研究[J]． 中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（8）：997-998.

（收稿日期：2012-05-24）