刘萍　郑慧玲　吴建伟　苏晓庆

摘要：以潮霉素抗性基因ｈｐｈ为筛选标记，以双元载体ｐＰＫ２为基本骨架，将增强型绿色荧光蛋白基因ｅｇｆｐ置于组成型启动子ＰｇｐｄＡ和色氨酸Ｃ终止子ＴｔｒｐＣ之间，构建了组成性表达ｅｇｆｐ的载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ，利用根癌农杆菌介导的遗传转化法，转入贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）表达。对转化子进行ＲＴ－ＰＣＲ和荧光显微镜检测，结果表明，ｅｇｆｐ基因在贵阳腐霉转化子中能稳定表达。

关键词：贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）；基因转化；绿色荧光蛋白；根癌农杆菌

中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5801-03

贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）是贵阳医学院苏晓庆教授于１９９４年分离得到的一株灭蚊真菌［１］。经研究证实它具有灭蚊能力较强、繁殖速度快、易于人工培养［２］和可移植性强以及对非靶生物相对安全等诸多优点［３，４］。由于昆虫病原真菌广泛存在于自然界，真菌制剂一旦释放到自然环境中，需要准确鉴别染病昆虫是否为人工释放的菌株制剂所致，而在真菌制剂中引入安全、可靠的遗传标记则为其提供了可能。增强型绿色荧光蛋白（Ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强３５倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，通过与目标基因融合，可进行真菌的细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记、突变体致病力检测、生态学行为以及与其他生物互作等研究，因此是目前标记研究真菌的重要手段之一。此次研究以贵阳腐霉菌丝体为受体材料，利用根癌农杆菌介导的遗传转化技术将含ｅｇｆｐ的表达载体转入贵阳腐霉，以获得带有ＥＧＦＰ标记的贵阳腐霉菌株，为研究其对蚊幼虫的入侵过程以及两者之间的互作模式打下基础。……