蔡丰波，魏 东，张长山

SELDI-TOF质谱技术分析家族性腺瘤性息肉病血清蛋白质谱

蔡丰波，魏 东，张长山

目的研究家族性腺瘤性息肉病患者血清蛋白质的变化，建立灵敏度和特异度高的家族性腺瘤性息肉病诊断模型。方法 利用SELDI-TOF-MS技术对18例家族性腺瘤性息肉病患者术前、术后血清蛋白质分别进行检测，IMAC30芯片结合蛋白质后，用蛋白芯片仪读取数据，分析得到区分两组的树状分类规则，并构建诊断模型。结果M8514.89蛋白质组成的模型可将两组准确分组，灵敏度和特异度分别为88.89%（16／18）和100% （18／18）。结论SELDI-TOFMS技术可将家族性腺瘤性息肉病术前、术后正确分组，可应用于家族性腺瘤性息肉病的诊断、鉴别、随访和手术时机的选择。

家族性腺瘤性息肉病；生物标记物；蛋白质组学；质谱；表面增强激光解吸离子化时间飞行质谱

家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）是一种常染色体显性遗传性疾病，如不治疗，其癌变率达到100%，目前尚缺乏有效的鉴别、随访和诊断方法。我们利用表面增强激光解吸附离子化时间飞行质谱（SELDI-TOF-MS）技术研究了家族性腺瘤性息肉病患者血清蛋白质组构型，发现血清中术前组与术后组有灵敏度和特异度较高的蛋白质将两组准确分组，其灵敏度和特异性均在89%以上。

1 材料与方法

1.1 一般资料18例标本取自2000～2010年中国人民解放军第150中心医院全军肛肠外科研究所保存的家族性腺瘤性息肉病患者术前和术后血清，各病例无其他慢性疾病史。所有病例采集空腹静脉血3～5 m L，经1 000 r／m in离心取上清保存于－70℃冰箱中备用。SELDI-TOF MS、IMAC30芯片购于CipherGen公司，试剂购自Sigma公司。

1.2 方法干燥管采集全血3～5 m L放于4℃冰箱，静置3 min，4℃1 000 r／m in离心30 m in。取10 μl血清，加20μL U9缓冲液（含9 moL／L尿素，2% CHAPS，50 mmol／L Tris-HCl，pH9.0），4℃振荡30 min，使蛋白变性；另取离心管，加10μL变性后样品，120μL U1（9倍稀释U9）。将芯片安装于Bioprocessor，加入50μL 100 mmol／L硫酸铜，4℃200 r／min振荡5 min。弃去硫酸铜，去离子水冲洗3次甩干。加入100 mmol／L醋酸钠（pH 4.0）50μL，4℃200 r／min振荡5 min。弃掉液体，加150μL 50 mmol／LHEPES（pH7.0）2次，弃去液体。取50μL样品加入芯片，4℃200 r／min振荡60 min后弃去液体，150μL的HEPES冲洗3次，弃去液体。取出芯片，自然风干，加0.5μL饱和SPA（sinapinic acid，芥子酸）2次。飞行质谱仪读取芯片。

1.3 统计学处理BioMarker Wizard软件对蛋白质含量进行方差分析。BioMarker Pattern软件对数据分组及相关性进行分析［1－2］。

2 结果

2.1 软件分析结果Biomarker W izard软件对两组数据进行分析，检测到蛋白31个，其中两组有17处蛋白存在的差异，具有统计学意义（P＜0.05）。用BioMarker W izard软件和BioMarker Pattern软件分析家族性腺瘤性息肉病术前组和术后组，结果发现M8514.89可将两组准确分组，产生终节点1和终节点2。符合M8514.89≤4.435的18例样本归类到终节点1，均为家族性腺瘤性息肉病术后组样本；满足M8514.89＞4.435样本归类于节点2均为家族性腺瘤性息肉病术前组样本。术前术后两组的M8514.89的平均值分别为10.37和2.08，其标准差分别为2.72和1.24。错误分组率3.70%。

2.2 分组准确率以蛋白质M8514.89所形成的分组模型，16／18家族性腺瘤性息肉病术前组和18／18术后组被准确分组，准确率为94.44%（34／36）。16／18家族性腺瘤性息肉病术前组和18／18术后组被准确分组，灵敏度88.89%（16／18），特异度100% （18／18）。

3 讨论

家族性腺瘤性息肉病（FAP）约占大肠癌的1%以下，多数具有出血、腹泻、黏液便等肠道症状，部分患者具有肠道外表现为Gardner综合征，或具有Turcot综合征，家族性腺瘤性息肉病常同时伴有中枢神经系统恶性肿瘤。1991年分离出APC （adenomatous polyposis coli）基因，其位于常染色体5q21，产物是由GSK-3β、β-catenin和axin组成的复合物。目前研究证实Wnt信号蛋白与APC密切相关，Wnt的基因产物是始终存在于机体中的调节组织发展的信号分子。APC基因突变导致Wnt表达产物持续异常升高，引起细胞过度增殖并最终导致肿瘤形成。Elias Gounaris等研究结果显示，在小鼠中不仅APC基因在FAP发病过程中起重要作用，间质环境，特别是肥大细胞，对于FAP的发病具有重要作用。通过消除肥大细胞的功能，息肉病能够有较大的缓解［3］。Anthony tighe等研究提示GSK-3抑制剂能够减少FAP治疗过程中不必要的常染色体不稳定性［4］。目前研究表明FAP的基因基础主要为APC 和MYH两种基因变异。

目前FAP诊治中仍有一些疑难问题存在：①FAP的早期病例发现十分困难，多数因有肠道症状而就诊，并因肠镜而发现，而此时多数已有癌变发生；②多发性腺瘤性息肉与FAP的鉴别诊断相当困难，多数FAP肠道外症状并不典型，家族史也多缺失；③早期FAP判断困难，行预防性肠切除手术时机较难准确把握，多数已经发现即行限期手术。因此早期发现FAP患者，同时进一步完善诊断标准包括早期FAP的诊断标准，以及手术时机的选择是目前FAP研究的难点问题。我们应用SELDI技术研究发现M8514.89可将FAP术前组和术后组准确分组，其平均值分别为10.37和2.08，P＜0.01。16／18家族性腺瘤性息肉病术前组和18／18术后组被准确分组，灵敏度88.89%（16／18），特异度100%（18／18）。

通过本实验，我们认为SELDI-TOFMS方法能够较灵敏和特异地发现FAP患者术前术后的血清变化，其灵敏度和特异度均较为满意，同时其差异蛋白术前组术后组表现有升有降，可能与肿瘤本身表达的蛋白、手术刺激引起机体的应激蛋白表达、肥大细胞等分泌的炎症因子等因素有关，这些尚有待进一步研究。

［1］ 高春芳，赵光，郑国宝，等.利用血清中蛋白质组构型鉴定Dukes A期结直肠癌［J］.解放军医学杂志，2005，30（6）：460－462.

［2］ 赵光，高春芳.血清中蛋白质组构型对结直肠癌的诊断意义［J］.癌症，2004，23（6）：614－618.

［3］Elias Gounaris，Susan E.Erdman，et al.Mast cells are an essential hematopoietic component for polyp development［J］.PNAS，2007，104：1997，7－19982.

［4］Anthony tighe，Arpita Ray-Sinha，et al.GSK-3 inhibitors induce chromosome instability［J］.BMC Cell Biology，2007，8：34.

Analysis of Proteom ics Spectra in Serum from Patients With FAP by SELDI-TOF Mass Spectrom etry

CAI Feng-bo，WEIDong，ZHANG Chang-shan
（PLA NO.150 Hospital，Luoyang 471031，China）

ObjectiveTo research the serum protein of FAP patients，and establish the diagnostic model of FAP with high sensitivity and specificity in application.MethodsSamples of sera with 18 preoperative and postoperative FAP patients were detected by surface enhanced laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry SELDI-TOF MS.After the surface of chips IMAC30 bind the serum protein，proteinchip reader of ciphergen inc，a part of SELDI-TOFMS，would detect the signs.Then the classification rule of tree was discoverer.The model of identification of FAP would be constructed by the classification rule of tree.ResultsAt the key M／Z values of M8514.89 protein contents of the two classes are obviously different by the software analysis.And corresponding sensitivity was 88.89%（16／18）and corresponding specificity was 100%（18／18）.ConclusionTHE SELDI-TOFMS could be used in the diagnosis，identification，followup and operative juncture of FAP.

adenomatous polyposis coli；biomarkers；proteomics；mass spectrometry，SELDI-TOF MS

R735.3＋4

A

1672－688X（2012）04－0251－02

2012－09－01

中国人民解放军第150中心医院，河南洛阳471031

蔡丰波（1980－），男，河南伊川人，主治医师，从事肛肠外科临床及研究工作。