王 燕 辛杭书 杨 方 陈常栋 张微微 李 敏 夏 科 张永根＊

饲料瘤胃非降解蛋白质（RUP）小肠消化率是影响奶牛的产奶量、生长性能的重要参数，因此，研究饲料RUP小肠消化率具有非常重要的意义。目前，国外对于应用移动尼龙袋法和三步体外法测定单一饲料蛋白质在小肠的消化率参数已有很多报道［1－3］，但国内研究很少，关于此方面的研究仅见于岳群等［4］和赵青余［5］的报道。在反刍动物小肠中，可代谢蛋白质是由瘤胃合成的微生物蛋白质、RUP及少量内源性蛋白质构成的［6］。研究证实，微生物蛋白质的小肠消化率为80%～85%［7］，在英国饲料评价系统中，饲料的RUP小肠消化率是90%［8］，而在 NRC（2001）［6］体系中，饲料RUP小肠消化率是80%。而大量试验表明［1－3］，RUP小肠消化率受饲料类型、饲料来源和加工方式等因素的影响很大。目前，反刍动物饲料蛋白质小肠消化率常用的估测方法有移动尼龙袋法、体外法以及酸性洗涤不溶氮（ADIN）估测法等。Webester等［9］提出根据ADIN值预测可消化RUP，这种方法简单快捷，是预测RUP小肠消化率最普遍的方法。移动尼龙袋法具有良好的重复性，且操作简单，目前已被广泛采用，但其仍依赖于装有瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的试验动物，成本较高。近年来，随着生理生化、酶学的发展，体外法也逐渐被人们所接受，虽然不能完全模拟体内的消化过程，但不需要试验动物，且成本低、易操作、重复性好。Calsamiglia等［1］建立了综合瘤胃尼龙袋法和三步体外法相结合的方法，较好地模拟了动物生理条件，省时省力，但原始三步体外法存在采用的胃蛋白酶（P－7012）价格昂贵，试验过程中使用三氯乙酸造成环境污染，不能测定RUP小肠可消化氨基酸等弊端，因此，Gargallo等［10］建立了测定RUP小肠消化率的改进三步体外法。改进三步体外法能否替代移动尼龙袋法准确快速测定RUP小肠消化率成为本试验研究的重点。本试验应用移动尼龙袋法、改进三步体外法和原始三步体外法测定饲料RUP小肠消化率，并用ADIN估测法预测RUP小肠消化率，进而分别将改进三步体外法、原始三步体外法和ADIN估测法测定的结果与移动尼龙袋法的测定结果进行相关性分析，研究替代移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率的适宜方法，并对饲料的常规营养成分和饲料RUP小肠消化率作回归分析，找出简单快速的测定RUP小肠消化率的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

13种待测样品为豆粕（黑龙江）、棉籽粕（新疆）、菜籽粕（山东）、葵花粕（辽宁）、芝麻粕（山东）、玉米胚芽粕（吉林）、玉米（黑龙江）、米糠（黑龙江）、米糠饼（黑龙江）、米糠粕（黑龙江）、大麦（黑龙江）、麦麸（黑龙江）和玉米麸质饲料（吉林）。待测样品粉碎过40目筛保存备用。

1.2 试验饲粮及饲养管理

选择3头体重约560 kg的带有永久瘤胃瘘管和十二指肠T型瘘管的奶牛作为试验动物，每天09：00和17：00饲喂，每次饲喂5 kg精料，自由饮水。参照 NRC（2001）［6］标准配制精料，每千克精料包含235 g玉米、200 g干酒糟、150 g菜籽粕、140 g葵花粕、110 g米糠粕、60 g糖蜜、55 g甜菜粕、20 g矿物质和维生素。粗饲料自由采食。

1.3 试验方法

根据Hvelplund［11］的方法获得瘤胃培养16 h的非降解饲料残渣，应用移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率。原始三步体外法参照Calsa miglia等［1］的原理和方法，其中选用的胃蛋白酶（P－7012，美国Sig ma公司）活力≥2 500 U／mg prot，效价100%；选用的胰蛋白酶（P－7545，美国Sig ma公司）活力是8 USP U，效价100%。改进三步体外法步骤参照Gargallo等［10］的原理和方法，具体步骤如下：称1 g残渣放入尼龙袋（Anko m R510，孔径50μm）里，热封。在每个培养瓶内放入3个袋子，在瓶内放入预培养的盐酸胃蛋白酶溶液［p H＝1.90，每升溶液中含有1 g胃蛋白酶（P－7000，美 国 Sigma 公 司），活 力 是 800～2 500 U／mg prot，效价是1∶10 000］，在39℃培养箱内振荡培养1 h。培养后，冲掉所有的液体，用自来水冲至澄清为止。把袋子放入培养瓶中，加入2 L预热的胰蛋白酶溶液［p H＝7.75，KH2PO4缓冲溶液，每升溶液中含有50μg的百里香酚和3 g的胰蛋白酶（P－7545，美国Sig ma公司，参数同上）］，在39℃培养箱内振荡培养24 h，转速为150 r／min。培养后，清洗小尼龙袋，直到水清为止。在55℃烘箱内烘48 h，分析袋内的氮含量。

1.4 计算公式

1.4.1 移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率［4］

1.4.2 原始三步体外法和改进三步体外法测定RUP小肠消化率［1］

1.4.3 ADIN估测法预测RUP小肠消化率［6］

1.5 统计分析

数据的统计处理用SAS 6.12软件包进行，以PROC REG过程对4种方法所测RUP小肠消化率数据进行线性回归分析，方差分析采用one－way ANOVA过程进行，结果以平均值±标准差表示。以Step wise Multiple Regression过程对营养成分与RUP小肠消化率之间的关系进行回归分析。

2 结 果

2.1 3种实测法测定的饲料RUP小肠消化率及相关性分析的结果

由表1可知，在蛋白质饲料中，移动尼龙袋法测定的豆粕RUP小肠消化率最高，依次是菜籽粕、棉籽粕、芝麻粕和葵花粕，最低的是玉米胚芽粕。在能量饲料中，移动尼龙袋法测定的玉米RUP小肠消化率最高，依次是米糠粕、大麦、玉米麸质饲料、米糠饼、麦麸和米糠，这说明玉米的蛋白质在瘤胃内不易降解，却易被小肠消化利用。移动尼龙袋法测得的豆粕、玉米、米糠粕和大麦RUP小肠消化率较高，均在90%以上。玉米胚芽粕、麦麸、玉米麸质饲料、米糠RUP小肠消化率较低，在80%以下，其中米糠RUP小肠消化率最低（69.27%），加工后米糠（米糠饼和米糠粕）RUP小肠消化率提高，其中米糠粕RUP小肠消化率提高至90%以上。

在蛋白质饲料中，改进三步体外法测定结果除豆粕外，其余5种蛋白质饲料测定结果与移动尼龙袋法测定结果差异不显著（P＞0.05）；在能量饲料中，改进三步体外法测定结果均显著低于移动尼龙袋法测定结果（P＜0.05）。原始三步体外法的测定结果均显著低于移动尼龙袋法测定结果（P＜0.05），除麦麸外，原始三步体外法测定结果也显著低于改进三步体外法测定结果（P＜0.05）。

表1 3种实测法测定的饲料RUP小肠消化率Table 1 Small intestinal digestibility of RUP measured by the three measured methods %

如图1和图2所示，在蛋白质饲料中，移动尼龙袋法的测定结果与改进三步体外法的测定结果存在显著相关（R2＝0.991 0，P＜0.05），在能量饲料中，这2种方法的测定结果也存在显著相关（R2＝0.813 9，P＜0.05）；如图3所示，在所测饲料中，2种方法的测定结果相关系数为0.838 3（P＜0.05）。如图4和图5所示，蛋白质饲料的移动尼龙袋法测定结果与原始三步体外法测定结果存在显著相关（R2＝0.809 5，P＜0.05），能量饲料的移动尼龙袋法测定结果与原始三步体外法测定结果也存在显著相关（R2＝0.807 7，P＜0.05）；如图6所示，在所测饲料中，移动尼龙袋法与原始三步体外法的测定结果相关系数为0.789 9（P＜0.05）。

图1 蛋白质饲料移动尼龙袋法与改进三步体外法测定结果的相关性分析Fig.1 Correlation analysis bet ween MBT and MTSP measured results of pr otein f eed

图2 能量饲料移动尼龙袋法与改进三步体外法测定结果的相关性分析Fig.2 Correlation analysis bet ween MBT and MTSP measured results of energy feed

图3 所测饲料移动尼龙袋法与改进三步体外法测定结果的相关性分析Fig.3 Correlation analysis bet ween MBT and MTSP measured results of all feeds

2.2 ADIN估算法预测的饲料RUP小肠消化率结果及其与移动尼龙袋法测定结果的相关性

由表2可知，ADIN估测法预测的蛋白质饲料RUP小肠消化率中，最高的是豆粕，依次是芝麻粕、葵花粕、棉籽粕、菜籽粕，最低的是玉米胚芽粕。ADIN估测法预测的能量饲料RUP小肠消化率中，最高的是大麦，依次是玉米麸质饲料、玉米、米糠饼、米糠和麦麸，最低的是米糠粕。ADIN估测法预测结果与移动尼龙袋法测定结果相比，2种方法得到葵花粕、米糠饼、麦麸、玉米麸质饲料的结果无显著差异（P＞0.05），表明ADIN估算法能预测葵花粕、米糠饼、麦麸和玉米麸质饲料RUP小肠消化率。ADIN估测法得到的芝麻粕和米糠RUP小肠消化率显著高于移动尼龙袋法测定的RUP小肠消化率（P＜0.05），得到的豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米胚芽粕、玉米、米糠粕、大麦RUP小肠消化率均显著低于移动尼龙袋法测定的RUP小肠消化率（P＜0.05）。

图4 蛋白质饲料移动尼龙袋法与原始三步体外法测定结果的相关性分析Fig.4 Correlation analysis bet ween MBT and TSP measured results of pr otein feed

图5 能量饲料移动尼龙袋法与原始三步体外法测定结果的相关性分析Fig.5 Correlation analysis bet ween MBT and TSP measured results of energy f eed

图6 所测饲料移动尼龙袋法与原始三步体外法测定结果的相关性分析Fig.6 Correlation analysis bet ween MBT and TSP measured results of all f eeds

如图7、图8和图9所示，蛋白质饲料、能量饲料及所测饲料的ADIN估测法预测结果与移动尼龙袋法测定结果均无显著的相关（P＞0.05）。

2.3 所测饲料的常规营养成分含量与RUP小肠消化率的回归关系

所测饲料的常规营养成分含量及移动尼龙袋法测定的RUP小肠消化率，如表3所示，将二者进行递推回归分析，得到回归方程，如表4所示。由表4第5个方程可知，RUP小肠消化率与粗蛋白质（CP）、可溶性蛋白质（SP）、中性洗涤纤维（NDF）、粗脂肪（EE）、净能（NE）呈显著相关，饲料的RUP小肠消化率与CP的含量呈正相关，与SP、NDF、EE和NE含量呈负相关，当引入的变量越多，回归方程系数越大，当引入CP、SP、NDF、EE、NE这5个变量时，回归方程：RUP小肠消化率（y）＝121.44 ＋ 0.40 CP －0.69SP－ 0.58 NDF －1.04EE－11.20 NE（R2＝0.801 1，P＝0.010 0）。

表2 移动尼龙袋法和ADIN估测法得出的RUP小肠消化率（干物质基础）Table 2 Small intestinal digestibility of RUP measured by MBT and ADIN （DM basis） %

图7 蛋白质饲料移动尼龙袋法测定结果与ADIN估测法预测结果的相关性分析Fig.7 Correlation analysis bet ween MBT measured results and ADIN esti mated results of pr otein feed

图8 能量饲料移动尼龙袋法测定结果与ADIN估测法预测结果的相关性分析Fig.8 Correlation analysis bet ween MBT measured results and ADIN esti mated results of energy feed

图9 所测饲料移动尼龙袋法测定结果与ADIN估测法预测结果的相关性分析Fig.9 Correlation analysis bet ween MBT measured results and ADIN esti mated results of all feeds

3 讨 论

3.1 3种实测法测定的不同饲料RUP小肠消化率的比较与分析

在蛋白质饲料中，除豆粕外，移动尼龙袋法测定的RUP小肠消化率与改进三步体外法测定的RUP小肠消化率无差异，表明改进三步体外法完全能替代移动尼龙袋法测定棉籽粕、菜籽粕、葵花粕、芝麻粕和玉米胚芽粕的RUP小肠消化率。对所测大多数饲料来说，2种体外法测定值普遍低于移动尼龙袋法测定值，这一方面是由于移动尼龙袋法经过了大肠消化的缘故［4］，另一方面可能是由于体内的复合酶能分解部分不易消化的蛋白质的缘故。

表3 所测饲料的常规营养成分含量及RUP小肠消化率 （干物质基础）Table 3 Conventional nutrient contents of measured feeds and small intestinal digestibility of RUP（DM basis） %

表4 预测RUP小肠消化率的回归方程 （干物质基础）Table 4 The regression equation of esti mated small intestinal digestibility of RUP（DM basis）

Woods等［12］采用移动尼龙袋法和原始三步体外法对棉籽粕、菜籽粕、葵花粕、大麦等饲料的RUP小肠消化率进行了测定，得出移动尼龙袋法测定的豆粕、棉籽粕的结果与本试验的结果接近，而大麦和葵花粕的测定结果比本试验测定结果偏低，这可能与饲料的品种及产地来源等因素有关。米糠加工后，RUP小肠消化率提高，其中米糠粕的RUP小肠消化率提高至90%以上，表明米糠加工后易于被小肠吸收利用，从而提高饲料的转化效率。由此可知，饲料的RUP小肠消化率受饲料品种及加工方式等因素的影响很大。反刍动物中，饲料在瘤胃内被降解是一种低效的过程，Chalpua等［13］指出，饲粮蛋白质应尽量避免瘤胃降解，为小肠的消化利用供应充足的氨基酸。根据饲料蛋白质、瘤胃降解蛋白质和RUP对产奶量、乳蛋白质含量的回归方程得出，产奶量和乳蛋白质含量会随着RUP含量的增加而增加。

改进三步体外法测定的米糠粕的结果比移动尼龙袋法测定结果低12.17%，原始三步体外法测定值比移动尼龙袋法测定值低19.17%，这与米糠在加工过程中产生抗营养因子有关，也可能是由于饲料原料的特性（CP、NDF、ADF等的含量）不同及操作方法细节（瘤胃内预培养的时间、移动尼龙袋的孔径）不同引起的。本试验所测得的试验数据除菜籽粕偏高外，其余饲料的测定结果与NRC（2001）［6］所列出的试验的结果（包括48个移动尼龙袋测定结果和6个三步体外法测定结果）的平均值接近，这可能由于菜籽粕的加工工艺不同导致抗营养因子发挥的作用不同所致。

由图1和图2所示，移动尼龙袋法和改进三步体外法测定能量饲料的相关系数（0.813 9）明显低于蛋白质饲料的相关系数（0.991 0），这表明改进三步体外法替代移动尼龙袋法测定蛋白质饲料的RUP小肠消化率比测定能量饲料的RUP小肠消化率效果更好。如图4和图5所示，移动尼龙袋法和原始三步体外法测定能量饲料的相关系数（0.807 7）低于蛋白质饲料的相关系数（0.809 5），这表明采用原始三步体外法替代移动尼龙袋法测定蛋白质饲料的RUP小肠消化率比测定能量饲料的RUP小肠消化率效果要好。如图3和图6所示，在所测饲料中，移动尼龙袋法测定结果与改进三步体外法测定结果的相关系数（0.838 3）也高于移动尼龙袋法与原始三步体外法测定结果的相关系数（0.789 9），这表明改进三步体外法比原始三步体外法能更好地替代移动尼龙袋法测定饲料RUP小肠消化率。Antoniewicz等［14］测定了不同来源的4种蛋白质补充料，得出移动尼龙袋法和三步体外法测定值有较强的相关（R2＝0.810 0，P＜0.05）。Van Straalen等［15］也报道了这2种方法有很强的相关（R2＝0.900 0）。Woods等［12］测定了豆粕、葵花粕、菜籽粕、棉籽粕、棕榈粕、大麦等12种饲料的RUP小肠消化率，得出这2种方法的测定结果有很强的相关（R2＝0.910 2）。岳群等［4］和赵青余［5］均认为体外法测定的小肠消化率与移动尼龙袋法测定的小肠消化率存在显著的相关性。

在所测饲料中，改进三步体外法测定的结果与移动尼龙袋法测定结果的相关系数显著高于原始三步体外法与移动尼龙袋法测定结果的相关系数，这说明改进三步体外法能更准确地模拟小肠环境，从而更准确地测定RUP小肠消化率。另外改进三步体外法主要有以下优点：1）改进三步体外法使用的胃蛋白酶（P－7000）与原始三步体外法使用的胃蛋白酶（P－7012）相比，价格降低22倍［11］，大大降低了成本；2）原始三步体外法采用三氯乙酸终止蛋白质反应，三氯乙酸具有强腐蚀性和强氧化性，造成环境污染，改进三步体外法取消了三氯乙酸的使用；3）改进三步体外法能测定过瘤胃氨基酸的小肠消化率，而原始三步体外法不能。

3.2 移动尼龙袋法与ADIN估测法的比较分析

ADIN估测法预测的葵花粕、米糠饼、麦麸和玉米麸质饲料的结果与移动尼龙袋法测定结果无显著差异，表明ADIN估测法能替代移动尼龙袋法得到葵花粕、米糠饼、麦麸和玉米麸质饲料的RUP小肠消化率。如图7、图8和图9所示，在蛋白质饲料、能量饲料及所测饲料中，ADIN估测法预测结果与移动尼龙袋法测定结果无显著相关，这表明ADIN估测法只针对某种特定的饲料，而不能替代移动尼龙袋法测定所有饲料RUP小肠消化 率。Naka maur等［16］和 Rogers等［17］研 究 提出，非牧草类植物来源的蛋白质在加热处理后ADIN和氮的消化率之间存在弱相关，试验数据表明，饲料经过加工后会诱发美拉德反应，从而使ADIN含量增加，然而饲料原料中ADIN部分可以被消化。因此，目前分辨不出ADIN消化的具体位置（瘤胃、小肠）以及其消化程度，也不清楚热损害吸收的氮是否利于奶牛的生长，因此，ADIN估测法对于测定RUP小肠消化率不一定适用［6］。

3.3 饲料常规营养成分含量与RUP小肠消化率的回归关系分析

ADIN估测法显然不能代替移动尼龙袋法测定饲料RUP小肠消化率，三步体外法测定RUP小肠消化率也存在酶价格高、周期长等弊端，因此，需要找到一种能快速准确预测RUP小肠消化率的方法。本试验结果表明，饲料RUP小肠消化率与CP、SP、NDF、EE、NE含量呈显著相关，与CP的含量呈正相关，而与SP、NDF、EE和NE含量呈负相关，且NE的系数绝对值最大，表明NE的大小直接影响着饲料RUP小肠消化率的高低。饲料的RUP小肠消化率与饲料的常规营养成分含量显著相关，引入的常规营养成分指标越多，回归方程的R2越大，当引入CP、SP、NDF和EE时，R2已达到0.750 3，当引入 CP、SP、NDF、EE和 NE时，R2达到0.801 1，能准确快速预测RUP小肠消化率。而 Woods等［12］也得出营养成分与体外法相关方程的相关系数为0.78。因此，在没有瘘管动物或三步体外法条件不允许的情况下，采用此种方法预测RUP小肠消化率比采用ADIN估测法得到的RUP小肠消化率准确得多。

4 结 论

① 应用原始三步体外法和改进三步体外法均可替代移动尼龙袋法测定饲料RUP小肠消化率，其中改进三步体外法替代移动尼龙袋法测定RUP小肠消化率效果更好，并且应用体外法替代移动尼龙袋法测定蛋白质饲料RUP小肠消化率比测定能量饲料RUP小肠消化率效果更好。

②ADIN估测法具有局限性，用饲料的常规营养成分含量可较好地预测RUP小肠消化率。

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