朱海珍，雷少华，刘春艳，焦 宇，于晓妍，高益敏

（1.湖南大学生物学院，湖南长沙 410082； 2.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头 014000）

pCold TF原核表达载体是一种插入蛋白可溶性标签的融合型冷休克表达载体，空载体融合表达的顺序为六聚组氨酸（His－Tag）、Trigger Factor（TF）、蛋白酶切位点和多克隆位点序列.蛋白酶切位点依次为HRV 3Cprotease，Thrombin和Factor Xa，用于去除融合蛋白的可溶性标签.TF是一种原核的核糖体结合伴侣蛋白，相对分子质量约4.8×104，它能够促进新生肽链的共翻译折叠，与目的蛋白融合表达，提高目的蛋白的可溶性.载体上带有冷休克表达系统，严格控制载体在低温条件下才能表达目的蛋白，进一步促进了目的蛋白的可溶性表达.

人CD81是一种四跨膜的非糖基化膜蛋白，由胞内的N端和C端、4个跨膜结构域、胞外小环和胞外大环4部分组成，相对分子质量约2.6×104，在B细胞、T细胞、肝细胞等多种细胞中均有表达.CD81参与细胞的粘附和信号转导，具有影响细胞增殖和分化等生物学功能［1］，是细胞表面的免疫调节分子［2］，并参与丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染宿主细胞，作为HCV的一个受体介导病毒颗粒进入宿主细胞［3］，HCV包膜蛋白E2与CD81胞外大环相互结合实现HCV的感染［4－5］.针对CD81的靶向药物及特异性抗体具有抑制HCV感染的潜在功能［6－7］，人膜蛋白CD81的原核表达与纯化，为今后靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81与HCV之间的关系奠定了基础.

pET28b是一种常规的原核表达载体，含有T7启动子、乳糖操纵子和多克隆位点序列等基本功能元件，在蛋白原核表达与纯化实验体系中应用广泛.在预实验中，将人cd81基因克隆到pET28b载体中尝试原核表达，发现没有可溶性目的蛋白的表达.pCold TF不仅有pET28b中的基本功能元件，还包含了冷休克表达系统和TF助溶蛋白，通过严格控制目的蛋白低温表达，以及TF的可溶性标记功能和分子伴侣作用，可以使一些表达困难的基因获得更高概率的可溶性表达.本课题改造pCold TF载体，在保留冷休克及融合表达系统的前提下，去除原载体上的His－Tag序列，一方面提高了人CD81蛋白融合表达的效率和可溶性，另一方面有利于融合蛋白中的TF助溶蛋白的去除，获得不含助溶蛋白标签的全长人CD81蛋白.

1 材料与方法

1.1 材 料

大肠杆菌菌株DH5α，BL21（DE3），pET28b质粒，人脾脏cDNA为本室保存；pCold TF质粒，DNA marker和T4连接酶购自宝生物公司（TaKa－Ra）；PCR试剂盒购自Roche公司；质粒纯化，DNA回收试剂盒，Factor Xa蛋白酶购自QIAGEN公司；限制性内切酶购自Promega公司；Ni－NTA镍离子亲和层析柱购自GE公司；PVDF膜和蛋白marker购自Bio－rad公司；anti－his鼠源单克隆抗体购自天根公司；羊抗鼠二抗购自Invitrogen公司；ECL发光试剂盒购自Thermo公司.

1.2 pCold TF载体的改造

1.2.1 pCold TF载体的改造方案

方案设计的基本原则是使用PCR分别扩增His－Tag前后的部分DNA片段，PCR产物两端分别带有限制性酶切位点，在His－Tag部分引入一个载体不包含的限制性酶切位点，分别酶切pCold TF质粒和两个PCR产物，再将这3个片段连接成新载体质粒，实现以限制性酶切位点替换His－Tag的目的.在NCBI上获取pCold TF载体序列，经搜索发现271～288位为His－Tag序列，109～114位和699～704位分别为限制性酶切位点NheⅠ和BubⅠ，且NheⅠ和BubⅠ在载体中是单一的酶切位点，因此可用于本载体的改造.PCR扩增109～270位的DNA片段P1和289～704位的DNA片段P2，并在P1 3′端和P2 5′端的引物中添加限制性酶切位点SpeⅠ.NheⅠ和BubⅠ双酶切pCold TF载体，NheⅠ和SpeⅠ双酶切P1，SpeⅠ和BubⅠ双酶切P2，再将酶切后的载体、P1和P2进行连接，获得重组质粒（图1）.

图1 pCold TF载体改造方案图Fig.1 Schematic diagram of vetor modification of pCold TF

1.2.2 pCold TF载体的改造方法

P1 5′端（NheⅠ）引物：5′－cgcgcgctagcgctagcgcatatccagtgta－3′；P1 3′端（SpeⅠ）引物：5′－ctgcagactagtcactttgtgattcatggtg－3′；P2 5′端（SpeⅠ）引物：5′－cgcgcactagtatgcaagtttcagttgaaaccactc－3′；P2 3′端（BubⅠ）引物：5′－ctgcaggcatgccgtcaacgtca－3′；引物合成与纯化由上海生工公司完成.应用PCR试剂盒扩增目的片段的反应体积为50μL.循环参数为：95℃预变性2min；然后95℃30s，60℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸5min.按照限制性内切酶的使用说明，分别双酶切pCold TF载体、P1和P2，使用T4连接酶将酶切后的片段相连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取生长在平板上的单克隆菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定.

1.2.3 pL118载体的酶切鉴定及测序

按照限制性内切酶的使用说明，用SpeⅠ单酶切pCold TF和pL118载体，用NheⅠ，SpeⅠ和BbuⅠ三酶切pCold TF和pL118载体，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.使用P1 5′端引物和P2 3′端引物对pL118进行正反测序，由上海生工公司完成.

1.3 蛋白的表达与纯化

1.3.1 空载体和重组质粒蛋白的表达

以人脾脏cDNA为模板，PCR扩增cd81基因的编码序列，将其装入pET28b或pL118载体中.5′端（NdeⅠ）引物：5′－cccatatgggagtggagggctgcaccaa－3′，将其克隆到pET28b载体中的3′端（BamHⅠ）引物：5′－cgggatcctcagtacacggagctgtt－3′，将其克隆到pL118载体中的3′端（PstⅠ和His－Tag）引物：5′－ctgcagctgcagtcagtgatggtgatggtgatggtacacggagctgttc cggat－3′.将需要表达蛋白的质粒转入大肠杆菌菌株BL21（DE3）中，37℃摇菌过夜，次日以1∶50扩大培养至OD值0.6～0.8，25℃诱导pET28b和pET28b－hCD81菌表达12h，16℃诱导pCold TF，pL118和pL118－hCD81表达24h，收集细菌沉淀，用于蛋白纯化或－80℃冻存备用.

1.3.2 人CD81蛋白的纯化

使用美国GE公司的Ni－NTA镍离子亲和层析柱纯化蛋白，由于pL118－hCD81质粒表达的融合蛋白是可溶性的，因此在非变性条件下（Binding Buffer：20mmol／L磷酸钠，500mmol／L NaCl，5mmol／L咪唑，PH7.4）裂解细菌和纯化目的蛋白.采用溶菌酶超声破碎法裂解细菌，将裂解液上清通过Ni－NTA层析柱后，用Washing Buffer（20mmol／L磷酸钠，500mmol／L NaCl，50mmol／L咪唑，PH7.4）洗涤，最后用Elution Buffer（20mmol／L磷酸钠，500mmol／L NaCl，500mmol／L咪唑，PH7.4）洗脱目的蛋白.收集的Elution Buffer即为目的蛋白，具体操作参照Ni－NTA层析柱使用说明.

1.4 Factor Xa蛋白酶切

40μL酶切反应体系：10μg融合蛋白，1UFactor Xa蛋白酶，Reaction Buffer至40μL.酶切反应混合液20℃孵育9h，然后混合液在Binding Buffer中透析过夜，再利用Ni－NTA层析柱获取不含TF助溶蛋白的全长人CD81蛋白，过程方法同上述人CD81蛋白的纯化.

1.5 Western blot分析

细菌裂解液上清或纯化的蛋白进行SDSPAGE，随即将电泳后的蛋白转移到PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1h，TBST震荡洗涤PVDF膜3次，每次5min.加入1∶1 000稀释的anti－his鼠源单克隆抗体，室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次5min.再用HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次5min.最后用ECL发光试剂显色.

2 结 果

2.1 pL118载体的构建与鉴定

以融合型冷休克原核表达载体pCold TF为模板，PCR扩增载体109～270位的DNA片段P1和289～704位的DNA片段P2，载体中271～288位为His－Tag序列，并在P1 3′端和P2 5′端的引物中添加限制性酶切位点SpeⅠ（图1），PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后分别出现约200bp和450bp的特异性条带，与预期P1和P2的大小一致（图2）.P1和P2分别双酶切处理后，与经过NheⅠ和BbuⅠ酶切的pCold TF载体片段连接，获得重组质粒.酶切鉴定结果显示，重组质粒能被SpeⅠ单酶切，pCold TF质粒则不能被酶切.NheⅠ，SpeⅠ和BbuⅠ三酶切重组质粒，出现与P1和P2大小相同的2个DNA片段，而pCold TF质粒只出现大小约650bp的DNA片段（图3）.DNA测序证实，重组质粒100～710位序列中His－Tag序列被限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT替代，其他序列保持不变，获得与设计序列完全一致的质粒，将原质粒和重组质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3），原核表达显示改造前后质粒的表达水平不受影响，均有54ku左右的空载蛋白表达（图4中泳道3和泳道4）.将此新质粒命名为pL118.

图2 pCold TF载体中DNA片段P1和P2的PCR产物Fig.2 PCR product of DNA fragment P1and P2in pCold TF

图3 pCold TF和pL118质粒酶切鉴定电泳图Fig.3 Gel electrophoresis of plasmids of pCold TF and pL118digested by restriction enzymes

图4 目的蛋白原核表达与纯化SDS－PAGE图Fig.4 SDS－PAGE gel of target proteins in prokaryotic expression and purification

2.2 人cd81在pL118中融合表达与纯化

pL118载体不含His－Tag序列，将cd81基因克隆到该载体时，需要通过PCR引物在基因的3′端添加His－Tag序列，以利于融合蛋白的纯化.将质粒pET28b－hCD81和pL118－hCD81分别转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，考马斯亮蓝染色SDS－PAGE胶上可见pL118－hCD81菌中CD81融合蛋白的可溶性表达，其大小约7.5×104，与理论预期值一致，而pET28b－hCD81菌则没有表达（图4中泳道2和泳道5）.应用Ni－NTA层析柱对CD81融合蛋白进行非变性蛋白纯化，在7.5×104处得到特异的蛋白条带（图4中泳道7）.

2.3 蛋白酶切去除TF助溶蛋白

应用pL118载体原核表达获得的人CD81融合蛋白包含4部分，即TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、CD81蛋白和His－Tag.为了去除TF助溶蛋白，使用Factor Xa蛋白酶对CD81融合蛋白进行酶切，即可将CD81融合蛋白分成TF助溶蛋白和CD81蛋白2个部分，再将酶切后的蛋白混合液通过Ni－NTA层析柱，利用Ni－NTA层析柱对CD81蛋白3′末端His－Tag的亲和性，实现TF助溶蛋白和CD81蛋白的分离，获得3′端含有His－Tag的全长人CD81蛋白（图5）.

图5 Western blot鉴定CD81融合蛋白的蛋白酶切及CD81蛋白的回收纯化Fig.5 Western blot analysis of protease cleavage of CD81 fusion protein and purification of CD81protein

3 讨 论

pCold TF载体拥有冷休克表达系统和TF助溶蛋白，一些表达困难的基因在pCold TF中有更高概率的可溶性表达.但是目的基因在pCold TF中表达得到的融合蛋白含有4.8×104的TF助溶蛋白标签，标签的分子质量偏大，对目的蛋白结构及功能有较大的影响，而去除TF却不方便，因为融合蛋白表达的顺序为His－Tag、TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、目的蛋白，利用蛋白酶对融合蛋白进行酶切后，目的蛋白将和His－Tag、TF助溶蛋白分开成为两个蛋白片段，目的蛋白不含His－Tag，不利于目的蛋白的再回收.本文对pCold TF载体进行改造，使之不含His－Tag序列，将目的基因克隆到该载体时，通过在目的基因3′端引物添加His－Tag序列，其融合蛋白表达的顺序为TF助溶蛋白、蛋白酶切位点、目的蛋白、His－Tag，其中His－Tag不仅可用于融合蛋白的纯化，也可用于融合蛋白酶切后目的蛋白的纯化，因为His－Tag仍然保留在目的蛋白上，也可作为标签用于Western blot中目的蛋白的检测，以及结合在Ni－NTA等载体上，用于进一步目的蛋白功能研究和特异性药物筛选等.

通过对pCold TF载体序列中限制性酶切位点的分析，发现位于His－Tag序列前端的NheⅠ和后端的BubⅠ是载体中单一的酶切位点，且载体不含酶切位点SpeⅠ.通过设计特定的PCR引物，并运用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法，成功去除pCold TF载体中的His－Tag序列，并且不影响原载体的蛋白表达能力，将此新质粒命名为pL118.pL118继承了原载体高效蛋白可溶性表达的优点，并使之有利于去除融合蛋白中的TF助溶蛋白，将His－Tag保留在目的蛋白上.在应用pL118表达融合蛋白时要特别注意的是：在目的基因3′端引物引入His－Tag序列时，将Hig－Tag序列放置在目的基因的编码序列和终止密码子之间，如果His－Tag序列放置在终止密码子之后，融合蛋白的表达将提前终止而不含His－Tag.

膜蛋白具有多种多样的细胞功能，是基础研究及药物开发的理想靶标，然而研究膜蛋白有一个难题，它们的过表达对宿主有毒性而限制蛋白产量，或产生包涵体增加纯化难度.人CD81是一种四跨膜蛋白，将其克隆到pET28b载体中尝试原核表达，发现没有可溶性目的蛋白的表达，关于CD81原核表达的文献报道也集中于CD81胞外大环可溶片段的表达.CD81参与细胞的粘附和信号转导，具有影响细胞增殖和分化等生物学功能，是细胞表面的免疫调节分子，并作为受体介导HCV感染宿主细胞.近期有报道称，CD81不仅是HCV感染中的一个受体，还可影响HCV RNA的复制［8］，或通过激活细胞的Raf／MEK／ERK信号通路而影响HCV在宿主细胞中的生活周期［9］，在慢性丙型肝炎病人的血清中，可溶性的CD81蛋白水平升高，并参与病人肝纤维化的形成［10］，因此对CD81的进一步研究具有重要的理论与实践意义.

4 结 语

本文将CD81克隆到pL118载体中，实现了CD81融合蛋白高效可溶性表达，使用Ni－NTA亲和层析柱对融合蛋白纯化，再利用Factor Xa蛋白酶去除TF助溶蛋白，成功获得含有His－Tag的全长CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化证实了pL118载体使表达困难的基因获得更高概率的可溶性表达，为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81与HCV之间的关系奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化方法具有一定的创新性，为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.

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