潘多锋，张月学，申忠宝，王建丽，张瑞博，李道明，高 超，孔福全，王 潇，刘录祥

(1.黑龙江省农业科学院草业研究所，黑龙江 哈尔滨 150086； 2.中国原子能科学研究院，北京 102413；3.中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物航天诱变技术改良中心，北京 100081)

牧草现代产业体系的建立，对推动区域牧草产业经济增长，拉动全国草业的持续健康发展，维护国家生态安全、粮食安全和能源安全具有重要的意义。牧草品种是草业发展的重要物质基础，优良品种的选育是草业研究的主要内容。诱变育种能突破原有基因库的限制，诱发新基因或新的基因组合，形成有现实或潜在利用价值的新种质资源[1]。目前，牧草辐射诱变育种的诱变源仍以60Co-γ射线和太空诱变为主[2-9]。近年来，我国有关离子束诱变育种的研究报道也较多[10-11]，而对于快中子辐射植物育种的研究较少[12-15]，特别是在牧草中鲜见报道。快中子属于高传能线密度(Linear Energy Transfer，LET)照射，易产生难以修复的DNA双链断裂，其相对生物学效应(Relative Biological Effectiveness，RBE)较高。本试验应用14 Mev快中子辐射羊草(Leymuschinensis)、无芒雀麦(Bromusinermis)和老芒麦(Elymussibiricus)3种多年生禾本科牧草种子，对辐射后牧草种子的萌发及幼苗生长进行分析，旨在明确快中子辐射对3种禾草的损伤效应特征，为牧草快中子诱变育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 供试材料为黑龙江省农业科学院草业研究所保存的野生东北羊草、无芒雀麦和老芒麦种子。

1.2辐射处理 在中国原子能科学研究院对3种牧草种子进行快中子辐射处理。快中子辐射能量为14 Mev，剂量分别为3.60×1011、7.10×1011和3.54×1012个·cm-2(分别记作T1、T2和T3)。以同一批次相同数量未经处理的种子作为对照。

1.3发芽试验 参考中华人民共和国牧草种子检验规程(GB/T 2930.4-2001)进行发芽试验。将上述3种牧草处理及对照种子放在直径9 cm的培养皿内，内铺两层滤纸。每处理3次重复，每重复选取50粒饱满种子。发芽温度16 ℃/28 ℃，12 h黑暗/12 h光照。从第1次调查发芽开始，每天调查1次直至萌发结束。3种牧草发芽统计时间不同，羊草从第6天开始调查发芽，发芽时间为20 d；无芒雀麦从第7天开始调查，发芽时间为14 d；老芒麦从第5天开始调查，发芽时间为12 d。发芽试验结束时记录根长和苗高，并计算发芽指数(GI)和活力指数(VI)，对仅胚根或胚芽突破种皮而没有伸长的种子不记录其根长或苗高。

GI=∑(Gi/Di)；

VI=GI×Ss。

式中，Gi为第i天的发芽率，Di为发芽天数[16]，Ss为幼苗高度[16]。

1.4统计分析 利用SPSS 11.0软件进行数据统计，Excel制图。

2 结果与分析

2.1快中子辐射对3种禾草种子发芽率的影响 辐射处理后羊草的发芽率极显著低于对照(P<0.01)，辐射剂量越大种子发芽率越低。T1、T2和T3的发芽率依次为45.0%、31.7%和26.3%，对照为64.7%，处理T3的发芽率仅为对照的40.65%(图1)。快中子辐射降低了无芒雀麦的发芽势，其中，T3与对照和T1差异极显著(P<0.01)。发芽率的统计结果显示，低剂量辐射可提高无芒雀麦种子的发芽率(T1的发芽率是100%，对照为98.7%)，而高剂量辐射降低其发芽率(图2)。快中子辐射处理促进老芒麦种子的萌发，种子的发芽势和发芽率都高于对照(P<0.01)，各处理和对照间差异不显著(P>0.01)(图3)。在本试验的辐射剂量范围内，老芒麦种子的发芽率随着辐射剂量的增加呈现先增大后降低的趋势(y=-2.775x2+14.245x+75.775，R2=0.638 1)。试验结果表明，快中子辐射对牧草种子发芽率的影响因牧草种而异。

图1 快中子辐射对羊草的发芽势和发芽率的影响Fig.1 Effects of fast neutron irradiation on germination vigor and rate of Leymus chiensis seed

图2 快中子辐射对无芒雀麦的发芽势和发芽率的影响Fig.2 Effects of fast neutron irradiation on germination vigor and rate of Bromus inermis seed

图3 快中子辐射对老芒麦的发芽势和发芽率的影响Fig.3 Effects of fast neutron irradiation on germination vigor and rate of Elymus sibiricus seed

2.2快中子辐射对3种禾草种子发芽指数和活力指数的影响 快中子辐射处理后羊草种子发芽指数和活力指数都极显著低于对照(P<0.01)，其变化趋势与发芽势和发芽率相似，表现为随辐射剂量增加而降低(图4、图5)。其中，处理T3的发芽指数和活力指数降低至17.8和16.4，分别为对照的29.3%和3.7%。统计结果表明快中子辐射能降低羊草种子活力，抑制其种子萌发速度。无芒雀麦发芽指数的变化趋势与羊草相似，除T3处理与对照差异显著外(P<0.05),其他处理间差异均不显著(P>0.05)。处理T1中无芒雀麦种子活力指数高于对照，T2和T3极显著低于对照。快中子辐射后老芒麦发芽指数和活力指数的变化趋势相反，低剂量辐射提高老芒麦的发芽指数(T1的发芽指数为105，对照为90.4)，高辐射剂量辐射发芽指数低于对照。活力指数变化趋势为随辐射剂量的增加，活力指数先降低后上升，T1和T2的活力指数极显著低于对照和T3。T3的活力指数比对照高14.5%，但差异不显著。

图4 快中子辐射对3种禾草的发芽指数的影响Fig.4 Effects of fast neutron irradiation on germination indexes of three grass spicies

图5 快中子辐射对3种禾草的活力指数的影响Fig.5 Effects of fast neutron irradiation on vigor indexes of three grass spicies

2.3快中子辐射对3种禾草幼苗生长的影响 快中子辐射处理对3种牧草根长和苗高的影响不同。快中子辐射抑制羊草根和苗的生长，根长和苗高随辐射剂量的增加呈显著下降趋势(P<0.05)(表1)，羊草对照的根长分别是T1、T2、T3的2.87、3.18和11.02倍，对照的苗高分别是3个处理的2.91、3.19和7.91倍。试验结果说明高剂量辐射对羊草根的抑制作用大于对苗的抑制作用。处理T1无芒雀麦根长和苗高都高于对照，但差异不显著(P>0.05)，而T2和T3显著低于对照。结果表明,在试验的剂量范围内，低剂量的快中子辐射可促进无芒雀麦幼苗的生长，高剂量则抑制其生长。快中子处理后老芒麦幼苗生长的变化趋势与无芒雀麦相反。T3处理根长比对照增加27.4%，苗高增加26.6%，T1和 T2显著低于对照。

表1 快中子辐射对3种禾草幼苗生长的影响Table 1 Effects of fast neutron irradiation on seedling growth of three grass spicies cm

3 讨论与结论

羊草是一种多年生根茎禾草，为旱生草原、盐生草甸的优势种，是我国重要的优良牧草之一，也是建立栽培草地和治理盐碱化草地的理想草种[17]。羊草在自然生境中以无性繁殖为主，有性繁殖为辅，其本身固有的“三低”问题(羊草草地的结实率仅为20%～40%，抽穗率为30%～40%，发芽率在10%～50%[18-21])严重限制了它在生产中大面积的应用。我国羊草育种工作还处于起步阶段，羊草育成品种较少，“三低” 问题依然存在，羊草育种研究严重滞后于生产实践的需要。因此，把常规选育和诱变育种(空间诱变、高能粒子照射、γ辐射等)结合起来，充分利用各种突变类型创造满足不同需要的羊草品种，尤其是选育高结实率、高抽穗率和高发芽率的羊草新品种和遗传材料，是今后羊草育种的重要研究课题之一。

不同植物品种的种子萌发及幼苗对快中子辐射及辐射剂量的敏感性不同。张圣君[22]在研究中子和电子束辐照对水稻(Oryzasativa)等农作物育种的影响时得出十字花科植物比禾本科植物耐辐射。王丹等[23]报道，中子辐射两种观赏羽衣甘蓝(Brassicaoleraceavar.acephala)的半致死剂量、过氧化物酶和过氧化氢酶活性等差异明显。本试验发现快中子辐射对3中牧草种子萌发及幼苗生长的影响不同，具体表现为快中子辐射降低羊草种子的发芽率、萌发速度和种子活力，同时抑制其幼苗生长。低剂量快中子辐射(3.60×1011个·cm-2)能提高无芒雀麦种子萌发能力(种子发芽率和种子活力)，促进其幼苗生长，高剂量辐射有降低和抑制作用。快中子辐射提高老芒麦种子的发芽率，在试验辐射剂量范围内，剂量越高，种子活力指数越大，且幼苗生长越好。

在植物辐射诱变育种中常以种子发芽率作为判定辐射半致死剂量及适宜辐射剂量范围的标准。本试验设置的辐射间隔较大，加之3种牧草的发芽率对中子辐射和辐射剂量的响应不同，未能准确地确定它们的半致死剂量。本试验初步认为，羊草和无芒雀麦适宜低剂量辐射处理，辐射剂量应小于3.60×1011个·cm-2，而老芒麦适宜高剂量辐射。另外，应对辐射后的活化苗进行系统的研究，包括细胞学、形态学、生理生化、营养品质等方面的研究，以期得到变异单株或有益突变体。

快中子辐射育种技术优于γ射线、X射线和化学诱变育种方法[24]，具有广阔的发展前景。为了提高牧草快中子辐射育种的效率，需要进一步研究不同牧草品种的最适辐射剂量、诱变机理(细胞、分子水平)、诱变后代的遗传稳定性和分化规律及其分子生物学基础。

[1] 刘录祥,王晶,赵林姝,等.作物空间诱变效应及其地面模拟研究进展[J].核农学报,2004,18(4):247-251.

[2] 马建中,鱼红斌,伊虎英.关于牧草辐射育种几个问题的探讨[J].核农学报,2000,14(3):167-173.

[3] 郭爱桂,刘建秀,郭海林,等.辐射技术在国产狗牙根育种中的初步应用[J].草业科学,2000,17(1):45-47.

[4] 王传海,郑有飞,王鑫,等.UV-B辐射增加对黑麦草生长及产量影响的初步研究[J].草业学报,2005,14(1):78-81.

[5] Liu L,Van Zanten L,Shu Q Y,etal.Officially released varieties in China[J].Mutation Breeding Review,2004,14:1-62.

[6] 郑家团,谢华安,王乌齐,等.水稻航天诱变育种研究进展与应用前景[J].分子植物育种,2003,1(3):367-371.

[7] 胡繁荣,赵海军,张琳琳,等.空间技术诱变创造优质抗逆黄叶高羊茅[J].核农学报,2003,18(4):286-288.

[8] 温贤芳,张龙,戴维序,等.天地结合开展我国空间诱变育种研究[J].核农学报,2004,18(4):286-288.

[9] 贾玉芳,陈曙,柴明良.γ射线对沟叶结缕草愈伤组织再生和耐盐性的影响[J].草业学报,2010,19(5):25-30.

[10] Cheng B J,Kan X Z.A preliminary study on DNA mutation induction of maise pollen implanted by low enery N+beam[J].Plasma Science & Technology,2001,3(1):659-664.

[11] 程备久,李展.氮离子注入棉花种子的诱变效应[J].核农学报,1993,7(2):73-80.

[12] 牛占歧,王学智,朴禹伯,等.快中子辐照育种——兰辐黑麦芒(92)1号[J].原子能科学技术,1999,33(1):66-70.

[13] 张文艺,焦玲,星正治.0.5 MeV单能中子照射洋葱干种子后在根尖细胞内诱发微核的相对生物效应[J].中国辐射卫生,2005,14(4):255-256.

[14] 张志伟,王丹,张冬雪,等.快中子照射唐菖蒲球茎的损伤作用初探[J].辐射研究与辐射工艺学报,2005,25(1):51-54.

[15] 张文艺,焦玲,星正治.0.2 MeV中子照射洋葱干种子后在根尖细胞内诱发微核的相对生物效应[J].辐射研究与辐射工艺学报,2004,22(6):375-377.

[16] 上海植物生理学会.植物生理学试验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1985:81.

[17] 刘书润,刘钟龄.内蒙古锡林河流域植物区纲要[A].中国科学院内蒙古草原生态定位站.草原生态系统研究3 [C].北京:科学出版社,1988:261.

[18] 王克平.羊草物种分化的研究——Ⅰ.野生种群的考察[J].中国草地学报,1984(2):32-36.

[19] 杨允菲,杨利民,张宝田,等.东北草原羊草种群结实特性与气候年变化的关系[J].植物学报,2000,42(3):294-299.

[20] 赵传孝,杨根凤,张国瞳,等.羊草种子发芽率的研究[J].中国草原,1986(5):54-56.

[21] 刘彩红,李成云.GA3浸种对羊草种子发芽和幼苗生长的影响[J].草业科学,2011,28(5):797-801.

[22] 张圣君.中子和电子束辐照对水稻等农作物育种的影响[J].上海大学学报(自然科学版),1999,5(5):388-392.

[23] 王丹,任少雄,苏军,等.中子辐照对观赏羽衣甘蓝种子萌发及幼苗生长的影响[J].福建农林大学学报(自然科学版),2008,37(3):261-264.

[24] 吴兆苏.小麦育种学[M].北京:农业出版社,1990:120-144.