张树杰，班 博，李艳英，耿厚法

(1天津医科大学研究生院，天津300070;2济宁医学院附属医院)

2型糖尿病(T2DM)以葡萄糖和脂类代谢异常为主要特征，氧化应激在DM及其并发症中发挥重要作用。硫氧化还原蛋白(TRX)系统是分布广泛的小分子多功能蛋白，作为体内重要的还原系统有多种功能。硫氧还蛋白结合蛋白-2又称硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)，是氧化应激的介导因子，它可与TRX结合并抑制TRX活性［1］。2010年，我们观察了α-硫辛酸(LA)对DM大鼠下丘脑组织氧化应激及TRX-1、TXNIP影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠30只，体质量180～200 g(山东省新华鲁抗动物实验中心)。722型分光光度计(上海分析仪器厂)，DYY-8C型凝胶电泳仪(北京六一仪器厂);链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，LA(德国 STADA公司)，丙二醛(MDA)及总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及建模 将大鼠用普通饲料喂养1周后，随机分为正常对照组10只、实验组20只。对照组用普通饲料喂养，实验组用高脂饲料(在60%的基础饲料中加5%蛋黄粉、20%蔗糖、15%猪油混合)喂养。实验组饲养4周后，禁食12 h，将STZ溶于0.1 mol/L枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液(pH 4.2)中，配成浓度1%的溶液，一次腹腔注射30 mg/ kg。72 h后取尾静脉血检测血糖，血糖 ＞16.7 mmol/L为DM建模成功。实验组20只均建模成功，继续高脂饮食4周后，随机分为LA组、DM对照组(DC组)各10只;LA组给予LA 120 mg/(kg· d)、干预4周，DC组给予生理盐水2 ml/d。实验期间，大鼠自由摄食、饮水，每周测血糖、体质量一次。对照组用等量枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。

1.2.2 MDA、T-AOC检测 LA干预4周后，各组均禁食12 h，用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，取下丘脑，将整个下丘脑取出置液氮冻存，再转入－80℃冰箱冻存。采用RT-PCR法、南京建成生物研究所提供的试剂盒检测MDA、T-AOC。

1.2.3 TRX、TXNIP mRNA检测 根据Trizol说明书，从各组下丘脑组织中提取总RNA，用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度。在25 μL反应体系中，将1.5 μg的RNA逆转录得到cDNA。在20 μL体积的cDNA反应体系中，取1 μL用于扩增。用GADPH作内部参考对照，TRX-1、TXNIP及GADPH基因引物序列及PCR条件见表1。反应条件:94℃5 min，94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，与DNA标准分子量进行比较，用Biometra凝胶成像系统进行成像和图像分析，TRX、TXNIP mRNA表达用目的基因条带与GAPDH条带灰度值之比表示。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据以s表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

表1 TRX-1、TXNIP及GADPH基因引物序列及PCR反应条件

2 结果

2.1 各组下丘脑组织TRX-1、TXNIP mRNA表达比较 见表2。

2.2 各组下丘脑组织MDA、T-AOC比较 见表3。

3 讨论

近年研究证实［2］，氧化应激在DM及其慢性并发症的发生、发展中起重要作用。DM时通过多种途径导致氧自由基生成增多，从而影响组织细胞的代谢和功能，促进胰岛素抵抗发生，导致组织细胞结构和功能损伤。Brownlee［2］认为，DM慢性并发症如DM大血管病变(心血管、脑血管及下肢血管)、微血管病变(肾脏、神经及视网膜)都有一个共同的发病机制，即氧化应激。

表2 各组下丘脑组织TRX-1、TXNIP mRNA表达比较(相对灰度值，s)

表2 各组下丘脑组织TRX-1、TXNIP mRNA表达比较(相对灰度值，s)

注:与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与DC组比较，*P＜0.01

组别 n TRX-1/GAPDH TXNIP/GAPDH对照组10 0.39±0.13 0.39±0.09 DC组 10 0.58±0.16△ 0.68±0.17△△LA组 10 1.35±0.23* 2.12±0.23*

表3 各组下丘脑组织MDA、T-AOC比较(s)

表3 各组下丘脑组织MDA、T-AOC比较(s)

注:与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与DC组比较，*P＜0.01

组别 n MDA(nmol/mg) T-AOC(U/mg)对照组10 4.72±0.15 2.58±0.11 DC组 10 8.93±0.12△△ 1.15±0.09△△LA组 10 7.59±0.15△△＊ 2.47±0.09△＊

LA是线粒体脱氢酶的重要辅助因子，其可清除氧自由基和活性氧，发挥抗氧化作用，被称为“万能抗氧化剂”。动物及临床研究证实，LA可改善DM氧化应激状态，对DM慢性并发症有确切疗效。另外，LA也是重要的巯基化合物调节剂，现已证明，其可增加多种组织(包括大脑组织)中的谷胱甘肽和其他内源性抗氧化剂水平［3］。本研究显示，DM状态下，大鼠下丘脑组织MDA升高，T-AOC降低;提示DM大鼠的抗氧化能力明显下降，氧化应激水平明显升高，与Brownlee［2］研究结果一致。本研究还显示，LA组下丘脑组织MDA明显下降，T-AOC明显升高;提示LA能明显增强DM大鼠的抗氧化能力，改善其氧化应激能力。

TRX系统是机体重要的抗氧化防御系统，TRX-1是该系统的重要组成部分，是维持细胞内抗氧化防御蛋白还原状态的重要巯基还原酶，发挥多数巯基还原酶的抗氧化作用［4］。在DM所致的氧化应激增加状态下，TRX可还原并维持许多蛋白的作用，其抗氧化作用表现在两个方面［5］:①直接或作为某些过氧化物酶的电子供体清除氧自由基。②作为细胞内巯基还原酶，还原多种蛋白质的二硫键，使其恢复生理功能。TXNIP是TRX功能和表达的负性调节因子，通过结合TRX抑制其功能，发挥介导氧化应激的作用［1］。TXNIP是TRX-1的内源性抑制因子，可诱导氧化应激，改变细胞内氧化还原状态，与DM发生相关［6］。TXNIP与糖代谢和DM发生有密切关系，它可调节糖脂代谢途径中一些代谢转录程序的操纵基因，如PGC-1α、Foxo1、MondoA:Mix复合体［7］，与这些转录因子相互作用而调节葡萄糖代谢。研究表明，TXNIP高表达可致胰岛β细胞丢失、血糖升高;抑制TXNIP可减少糖毒性引起的胰岛β细胞丢失和死亡，延缓DM发生［8］。Lappalainen等［9］研究显示，DM大鼠下丘脑组织TRX、TXNIP基因转录水平明显升高，但其蛋白水平无明显变化。本研究发现，DM大鼠用LA干预4周后，其下丘脑组织TRX、TXNIP mRNA表达明显升高，与文献报道［9］结果一致。TRX系统是机体抗氧化防御系统的主要部分，是维持细胞内氧化还原稳态的第一线还原系统。因此我们推测，LA改善DM大鼠下丘脑组织氧化应激的作用至少部分是通过诱导DM机体TXNIP转录在细胞内平衡中发挥一定的负性作用实现的。

总之，本研究显示LA可改善DM状态下的下丘脑氧化应激状态，其部分机制可能是通过诱导DM机体TXNIP转录在细胞内平衡中发挥一定的负性作用实现的。然而，大剂量LA可诱导DM机体TXNIP转录，破坏TRX系统平衡，在细胞氧化还原中发挥一定的负性作用。因此，寻找合适的LA治疗剂量是下一步研究的重点。

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