王海莲，葛 伟，薛 江

(1山东大学第二医院，济南250033;2山东大学齐鲁医院)

性早熟是一种以青春期发育提前出现为特征的生长发育异常性疾病，是常见小儿内分泌疾病之一。性早熟分为中枢性、外周性两类，中枢性性早熟(CPP)又称为真性性早熟，多因下丘脑视前内侧核及弓状核分泌促性腺激素释放激素(GnRH)过多所致。近年研究发现，KISS-1基因产物Kisspeptin及其受体G蛋白偶联受体54(GPR54)对GnRH释放和青春期启动起重要作用，Kisspeptin/GPR54信号在青春期发生、发展中的作用受到广泛关注。目前，关于Kisspeptin/GPR54信号与CPP关系的研究较少。2010～2011年，本实验以N-甲基-DL-天冬氨酸(NMA)建立雌性大鼠CPP模型，检测其不同发育期下丘脑中KISS-1 mRNA、GPR54 mRN、GnRH mRNA的表达，以探讨Kisspeptin-GPR54-GnRH神经元轴在雌性大鼠CPP中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 NMA(购自Sigma公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒(购自 MBI公司)，SYBR Green Real-Time PCR Master Mix试剂盒(购自TOYOBO公司)。26日龄雌性SD大鼠50只，体质量55～70 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。饲养条件为室温20～26℃，每日固定光照14 h。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组 将50只大鼠随机分为对照1组(正常青春前期)、对照2组(正常青春早期)、对照3组(正常青春中期)、实验1组(性早熟青春早期)、实验2组(性早熟青春中期)各10只。自大鼠26日龄起至阴道口开放(VO)之日，实验组皮下注射NMA 40 mg/kg、每日2次，使其青春期提前;对照组皮下注射生理盐水0.2 ml/d。用药后，观察对照2、3组和实验组的VO情况。对VO大鼠每日行阴道细胞涂片，观察其性周期(顺序为发情期、发情后1期、发情后2期、发情间期、发情前期)变化和第1个发情间期(D1)出现时间。实验1组出现第1个发情前期时称体质量后断头处死，按1∶1比例同时处死对照1组;对照2组出现第1个发情前期、对照3组及实验2组出现第2个发情前期时均称体质量后断头处死。

1.2.2 黄体生成素(LH)检测 各组处死前，先用毛细管经其内眦静脉丛采血1 mL，分离血清后置于－20℃冻存，采用过夜温育放免法检测血清LH。

1.2.3 下丘脑组织超微结构观察 各组处死取下丘脑后，参照大鼠脑定位图谱，在其弓状核平面取1 mm×1 mm×1 mm组织，用4%戊二醛液固定48 h后，在电子显微镜下观察其超微结构。

1.2.4 性腺和性器官检测 各组处死后取其子宫及双侧卵巢，称量湿重后用10%甲醛液固定。对卵巢标本行常规石蜡切片(取最大截面)，HE染色，在光镜下观察卵巢黄体出现个数。对子宫标本行常规石蜡切片(取垂直横断面)，HE染色后，在光镜下用病理切片计算机图像自动分析系统测量子宫壁厚度。根据器官指数=器官湿重/体质量的公式，计算卵巢指数与子宫指数。

1.2.5 KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA检测 采用Real-Time RT-PCR法检测各组下丘脑中的KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表达。用Trizol试剂、一步法从下丘脑组织中提取总RNA，紫外线分光光度计测定其RNA浓度和纯度; OD260/OD280为1.8～2.0。以总RNA为模板，根据RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis试剂盒说明合成cDNA，逆转录条件为25℃10 min，37℃60 min，95℃ 5 min。采用 Primer5软件设计引物(略)，引物由 Invitrogen公司合成。根据 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix试剂盒说明，检测KISS-1、GPR54基因表达。反应体系包括2×Mix、Taq聚合酶、正向引物、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，加入ddH2O至20 μL。反应条件为95℃ 15 s变性，55℃5 s退火，72℃15 s延伸，共40个循环。扩增结束后分析熔解曲线，采用双标曲线法计算各基因的相对表达量，以对照1组各基因表达量作为对比标准。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以s表示，组间比较用t检验和单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组VO时间、D1、卵巢指数、子宫指数、子宫壁厚度、血清LH比较 见表1。

2.2 各组卵巢黄体出现个数 对照1组卵巢黄体出现1～2个/卵巢，实验1、2组和对照2、3组卵巢黄体出现3～5个/卵巢。

2.3 下丘脑组织超微结构 电镜下可见，青春前期组下丘脑弓状核GnRH神经元核较大，呈圆形或椭圆形，通常1个核仁，游离核糖体、高尔基体和线粒体较少;胞质中致密芯分泌颗粒和清亮小泡很少。实验组青春期GnRH神经元核较饱满，高尔基体和线粒体增多;胞质中致密芯分泌颗粒和清亮小泡增多，细胞器形态无明显异常。

表1 各组VO时间、D1、卵巢指数、子宫指数、子宫壁厚度、LH比较(n=10，s)

表1 各组VO时间、D1、卵巢指数、子宫指数、子宫壁厚度、LH比较(n=10，s)

注:与对照2、3组比较，aP＜0.05;与其他组比较，bP＜0.05;与对照2组、实验1组比较，cP＜0.05

组别 VO时间(d) D1(d) 子宫指数(×10－3) 卵巢指数(×10－4) 子宫壁厚度(×10－2mm) LH(mU/mL)对照1组 — — 1.29±0.41b 2.67±0.61b 57.8±9.96b 5.46±0.48b对照2组 37.1±1.66 41.9±1.73 2.07±0.25 4.71±0.84 79.7±12.54 6.80±0.36对照3组 37.3±2.45 42.1±1.41 2.78±0.88c 5.51±0.70c 100.2±10.01c 7.79±0.29c实验1组 33.2±1.87a 36.7±1.57a 2.08±0.39 4.57±0.81 81.3±11.33 6.81±0.22实验2组 33.3±1.88a 36.9±1.25a 2.74±0.65c 5.81±0.78c 101.1±9.42c 7.80±0.32c

2.4 各组下丘脑中KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表达比较 见表2。

表2 各组下丘脑中KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表达比较(s)

表2 各组下丘脑中KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表达比较(s)

注:与其他组比较，aP＜0.05;与对照2组、实验1组比较，bP＜0.05

组别 n KISS-1 mRNA GPR54 mRNA GnRH mRNA对照1组 10 0.95±0.41a 0.90±0.37a 1.04±0.67a对照2组 10 3.01±0.89 2.54±0.94 2.41±1.31对照3组 10 4.90±0.45b 4.40±0.92b 4.36±1.17b实验1组 10 3.36±0.81 2.86±0.88 2.68±1.21实验2组 10 5.09±1.55b 4.88±1.25b 4.21±1.97b

3 讨论

CPP表现为正常青春期发育提前，在青春期发育过程中，下丘脑GnRH神经元兴奋起重要作用，GnRH分泌旺盛是青春期发育的基础［1］。神经元兴奋性冲动传递，需要兴奋性神经递质和受体的协同作用。中枢神经系统的兴奋性氨基酸递质主要包括谷氨酸和天冬氨酸，NMA受体是主要的谷氨酸受体亚型，NMA是其重要的激动剂［2］。本研究采用皮下注射NMA方法建立CPP模型，与文献报道［3］相同。本研究显示，实验组VO、D1较对照组提前，表明大鼠青春期提前启动;各组卵巢指数、子宫指数、子宫壁厚度、卵巢黄体出现个数、LH及下丘脑GnRH mRNA表达均高于对照1组(与文献［4］报道相同)，且上述指标对照3组高于对照2组、实验2组高于实验1组，对照3组和实验2组、对照2组和实验1组无统计学差异;说明实验组大鼠的下丘脑—垂体—性腺轴逐步完全激活，较正常大鼠性发育提前，其进入青春期后的发育与正常青春期大鼠类似。GnRH主要由位于下丘脑弓状核的GnRH神经元分泌，本研究发现，实验组青春期弓状核GnRH神经元代谢逐渐活跃，分泌旺盛，与正常青春期大鼠类似。因此，皮下注射NMA可提前激活雌性大鼠的下丘脑—垂体—性腺轴，良好地模拟CPP的病理生理过程，建立理想的实验动物模型。

GPR54是一种新的孤儿G蛋白偶联受体［5］，在胰腺和胎盘中表达最丰富，在下丘脑、垂体、边缘系统、基底节中表达较丰富［5～7］。KISS-1基因是1996年在黑色素瘤细胞中发现的一种新型的肿瘤转移抑制基因［8］，Kisspeptin是KISS-1基因编码产生的多肽家族，其经蛋白水解产生一种含有54个氨基酸的生物活性肽Metastin，作为GPR54的天然配体［6］。Kisspeptin与GPR54结合可激活磷脂酶C，致细胞内磷脂酰肌醇、Ca2+增多，进一步激活细胞外调节蛋白激酶和P38细胞分裂素活化蛋白激酶途径，进行信号传导［7］。有研究表明，鼠类和人类的 KISS-1、GPR54基因突变均可影响正常青春期性发育和LH的脉冲式分泌，导致性腺功能低下或生育能力丧失［9］。Rhie等［10］对 CPP女童研究发现，其血清Kisspeptin明显升高，且与LH峰值、LH峰值/基值、LH/FSH呈正相关，认为Kisspeptin可作为诊断CPP的临床标志物。Shahab等［11］研究发现，在无生殖腺的雄性幼猴侧脑室注射Kisspeptin能刺激LH分泌，出现性早熟表现，表明Kisspeptin能打破青春前期哺乳动物GnRH分泌的中枢性抑制状态;并发现正常雌猴下丘脑KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA表达随青春期发育逐渐增加。本研究结果与其报道相似，表明Kisspeptin-GPR54-GnRH神经元轴活化能全面激活青春期哺乳动物的神经内分泌生殖轴。本研究表明，Kisspeptin与GPR54结合可致GnRH神经元活化，代谢活跃，GnRH产生增多，并可能伴随青春发育的全过程。

综上所述，NMA可提前激活下丘脑—垂体—性腺轴，导致雌性大鼠CPP。随着青春期发育，正常发育大鼠、CPP大鼠的下丘脑KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA及GnRH mRNA表达逐渐升高，提示Kisspeptin-GPR54-GnRH神经元轴在CPP的发生、发展中起重要作用，可能成为CPP治疗的新靶点。

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