任晓利， 刘太国， 刘 博， 高 利， 陈万权

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

小麦叶锈病是影响小麦产量和品质的主要病害之一，在世界各小麦种植区域均有分布。我国小麦叶锈病以西南、长江流域麦区发生较重，华北、东北麦区曾造成严重损失，成为生产上一个重要问题［1－2］。筛选和培育抗病品种是防治小麦叶锈病最为经济、安全和有效的方法。然而，由于抗叶锈品种的单一化种植和小麦叶锈菌新毒性的产生，经常导致品种抗锈性的“丧失”。因此，深入研究小麦叶锈病抗源及抗性基因是抗病育种的基础［3］。

截至2010年，小麦中已发现近100多个抗叶锈基因，其中72个被正式命名，67个被定位，39个抗病基因被标记［4］。来源于黑麦的Lr26与抗条锈基因Yr 9、抗秆锈基因Sr31、抗白粉基因Pm8连锁，广泛用于我国小麦抗病育种中，该基因与其他抗性基因复合存在可提高抗病性［5］。Lr20发现于普通小麦中，定位于染色体7 AL上，是抗白粉病基因Pm1和抗秆锈病基因Sr15基因簇的一部分。Lr20低温下对温度反应不敏感，表现有效的抗叶锈性，但当温度高于30．5℃时，完全失去抗锈作用［5］。Lr9 和Lr 19至今在我国表现很好的抗叶锈性，仍是有效的抗叶锈基因，在生产上有很大的利用价值［6］。

Lr9［7－8］、Lr19［9－10］、Lr20［11］、Lr26［12－14］等 17 个 抗叶锈病基因的RFLP、RAPD、AFLP标记已转化为稳定简便的STS（sequence tagged site，STS）、SCAR（sequence characterized amplified regions，SCAR）等标记，可以应用于分子辅助鉴定，为基因检测开辟了简捷可靠的途径。1988年Chamberian［15］等率先提出了多重PCR（multiplex poly merase chain reaction，MPCR）检测技术，即在同一反应体系中加入一对以上的引物，针对几个靶位点同时进行特异性扩增的PCR快速检测技术［16］。与单一基因分子标记的PCR相比，多重PCR在一次PCR中就可检测几个目标基因，同时该技术快速、简便、灵敏、可靠，从而使工作效率显著提高，成本明显降低。Procunier［17］构建了小麦抗叶锈基因Lr29－Lr25的复合PCR体系，可以在一次PCR中同时检测小麦品系中是否含有Lr29和Lr25。Su míková等［18］构建了小麦抗叶锈病基因Lr26－Lr37的复合PCR体系，检测了21个冬小麦品种，结果表明Lr37存在于4个品种中，一个品种含有Lr26，3个品种同时含有Lr26和Lr 37。孟颢光［19］等利用小麦条锈菌和叶锈菌的特异性SCAR标记引物，进行小麦锈菌的复合PCR检测，可准确区分小麦条锈菌和叶锈菌，提高检测效率。Ma W等［20］利用3对特异性引物构建了多重PCR反应体系，可以在一个PCR反应中检测3个小麦高分子量麦谷蛋白基因Glu－A1的Ax2＊亚基、Glu－B1的Bx7和Bx17亚基和Glu－D1的Dx5亚基4种基因型。而目前小麦抗叶锈病基因Lr9－Lr26、Lr19－Lr20的复合PCR检测体系尚未见报道。传统的抗病基因推导耗时、低效、需锈菌培养与接种鉴定，无法满足育种家对抗病育种要求，因此，利用已知小麦抗叶锈病基因分子标记，开发简单、快速和有效的多重PCR技术对加快其在抗病育种上的应用，缩短育种年限，加快后代抗病品种准确选择，促进小麦抗叶锈病分子标记辅助育种的实用化具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料

以春小麦‘Thatcher’为背景的28个已知抗叶锈病小麦近等基因系和16个已知基因载体品系中，Lr14a引自美国农业部禾谷类锈病室，Lr37引自法国，Lr38的载体品系为‘Zhong＃4’（A inter mediu m）［21］，其余均由国际玉米小麦改良中心（CI MMYT）提供。

供试的116个待测小麦品种（系）绝大多数属中国目前小麦主产区（16个省、市、自治区）大面积种植的生产品种和2004年、2005年通过国家小麦品种审定委员会审定的品种及一些新育成品种，如兰天系和中梁系品种（系）（表1）。

1．2 STS分析

参照Gill等［22］提供的CTAB法提取小麦苗基因组DNA，并经改进。根据已报道Lr9和Lr26的STS标记序列（表2），由上海生工生物工程有限公司合成引物。扩增试验均独立重复2次。

PCR反应体系为10μL，含5μL 2×Taq Plus PCR Master Mix，每条引物（5μmol／L）0．5μL，模板DNA 100 ng。PCR反应程序为94℃，3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳后EB染色，用伯乐公司Gene－Doc凝胶成像系统观察扩增结果。

Lr9－Lr26复合 PCR反应体系为20μL，含10μL 2×Taq Pl us PCR Master Mix，Lr26 每条引物（5μmol／L）0．5μL，Lr9 每条引物（5μmol／L）1μL，模板DNA 100 ng；Lr19－Lr20 复合PCR反应体系为20μL，含10μL 2×Taq Plus PCR Master－Mix，Lr20 每条引物（5μmol／L）0．5μL，Lr19 每条引物（5μmol／L）1μL，模板 DNA 100 ng。PCR反应程序为94℃，3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳后EB染色，用凝胶成像系统观察扩增结果。

表1 供试116个小麦品种（系）的名称和系谱

续表1

表2 用于抗叶锈基因鉴定的STS分子标记

2 结果与分析

2．1 STS标记的特异性检测

用以春小麦‘Thatcher’为背景的28个近等基因系和16个已知基因载体品系材料对Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的STS标记进行特异性检测，Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的STS标记成功地从近等基因系Tc Lr9、Tc Lr26、Tc Lr19和Tc Lr20中扩增出1 000、210、130 bp和542 bp DNA条带，与报道片段大小相同（表2），在其他43个小麦材料（包括近等基因系轮回亲本‘Thatcher’）中未扩增出特异性DNA片段，证明标记STSLr9、STSLr26、STSLr19和STSLr20具有选择特异性（图1～4）。

2．2 供试小麦品种的PCR检测

各供试小麦品种基因组DNA 重复扩增STS 2次，结果表明116个小麦品种中47个品种：‘石4185’（L4，表1第4号，下同）、‘邯6172’（L8）、‘邯4564’（L11）、‘绵阳28’（L16）、‘小偃22’（L18）、‘京东8号’（L20）、‘淮麦20’（L23）、‘潍麦8号’（L25）、‘鲁麦1号’（L34）、‘陕229’（L35）、‘高优503’（L37）、‘郑麦98’（L38）、‘绵农4号’（L40）、‘衡95观26’（L41）、‘兰天10号’（L42）、‘周麦16’（L45）、‘山农664’（L46）、‘宛麦369’（L47）、‘GS郑麦004’（L56）、‘周麦17’（L57）、‘冀麦21’（L59）、‘衡5229’（L61）、‘连麦2号’（L68）、‘周麦18’（L70）、‘泛麦5号’（L71）、‘百农 AK58’（L72）、‘许麦29’（L79）、‘衡7228’（L80）、‘河东 TX－006’（L81）、‘兰天11’（L83）、‘兰天14’（L85）、‘兰天20’（L90）、‘兰天21’（L91）、‘兰天22’（L92）、‘中梁22’（L94）、‘中梁24’（L95）、‘中梁9589’（L100）、‘A3－5’（L101）、‘天9633－5’（L102）、‘轮选987’（L105）、‘徐856’（L106）、‘石家庄8号’（L107）、‘花培5号’（L108）、‘项麦986’（L110）、‘郑麦9694’（L113）、‘洛麦21’（L114）和‘04中3604’（L115）可扩增出1条210 bp的Lr26特异性DNA条带，而其他品种中未检测到该条带（图5）；‘中梁26’可扩增出1条130 bp的Lr19特异性DNA片段（图6），116个品种中未扩增出与近等基因系材料Tc Lr 9和Tc Lr 20特异性目的DNA片段相同的产物（图7和图8）。

图5 116个供试小麦品种Lr26 STS标记扩增结果（1～116为品种编号，名称见表1）

2．3 供试小麦品种的Lr9－Lr26和Lr19－Lr20的复合PCR检测

化PCR反应体系和循环条件，构建Lr9－Lr26和Lr 19－Lr20的复合PCR体系。结果表明，引物组合A：（Lr9 J13／1，Lr9 J13／2）和（Lr26F：IB，Lr26 R：IB）可以专一性扩增出抗叶锈基因Lr9和Lr 26的1 000 bp和210 bp特异性DNA片段（图9）；引物组合 B：（Lr19Gb F，Lr19Gb R）和 （Lr20STS638－L，Lr20STS638－R）可以专一性扩增出抗叶锈基因Lr19和Lr20的130 bp和542 bp特异性DNA片段（图10）；Lr19、Lr20和Lr26的特异性DNA序列见图11－图13。供试小麦品种Lr9－Lr26和Lr19－Lr20的复合PCR检测（图略），扩增结果与单个Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的PCR检测的结果一致。

图13 Lr26特异片段序列（图中下划线字母为引物序列）

3 讨论

多重PCR较单个PCR高效、灵敏、特异且易区分，具有实际应用价值。但其对试验条件要求比较严格，如何提高多重PCR的稳定性和重复性是该技术能否大规模应用于分子育种辅助选择的关键。引物的特异性是PCR扩增成功的关键，而MPCR反应条件的优化则是多重PCR扩增成功的关键，基于常规循环量下，模板、各引物浓度及适宜退火温度起了决定作用。初次进行多重反应时，首先选择引物退火温度相近，引物间二聚体较少的组合；本试验根据引物组合A和B中的各个引物的退火温度设定了从52～67℃的12个退火温度梯度，并且各种引物按相等的摩尔数添加，模板也按相等的摩尔数添加，摸索出最适的退火温度；然后根据要增加“弱”基因的引物量，而要减少“强”基因的引物量的原则，改变反应中各种引物的比例；复合PCR的程序仍旧遵循单个PCR的程序。

对于建立在PCR技术上的特异性引物分子标记，只需极少的DNA样品即可快速、可靠、便捷地检测和追踪，不受环境影响，因而成为首选的检测方法；尤其是与抗病基因紧密连锁的单一位点有无的STS标记，可直接在PCR管中加入溴化乙锭，通过在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物，比较DNA间的差异，省略电泳步骤，使检测方法变得方便、快速地检测大量个体。而在一次扩增中获得两个或多个STS标记的多重PCR无疑较单个PCR具有更高的扩增效率，较低的成本，节约试验样品，可获得更为丰富的信息。因此，在更多与抗病基因紧密连锁特异性分子标记开发的基础上，复合PCR技术应用于抗病育种的分子标记辅助选择具有广泛的应用前景。

1971年，我国从罗马尼亚引进了以‘洛夫林’为代表的小麦－黑麦的1BL／1RS易位系新种质，当时因其综合性状较好能抗3种锈病和白粉病，被育种家广泛利用，选育出一大批新品种，导致目前我国小麦品种中含有Lr26和Yr9的频率很高。周阳等报道［23］，北 方 冬 麦 区 1BL／1RS 易 位 系 出 现 频 率 为59%，黄淮冬麦区频率42%。在供试的116个品种中，利用分子标记检测出47个品种中含有Lr26（40．5%），与利用Yr 9进行分子检测结果一致（文章未发表）。在利用28个具有不同毒性（组合）的小麦叶锈菌单孢分离物对所供试品种进行基因推导时，推导出43个品种含有Lr26，与分子检测结果一致，其中‘绵阳28’（L16）、‘小偃22’（L18）、‘高优503’（L37）和‘徐麦29’（L79）虽PCR检测含有Lr26，但未推导出其含有Lr26，可能不同菌系的鉴别力会受到环境条件的微观作用，这4个品种中也可能存在对Lr26的抑制基因；或者发生了遗传重组；或者1B／1R代换系或易位系存在有抗病基因Lr26丢失的情况。对小麦抗叶锈病基因Lr26的抑制性尚未见相关文献报道，有待进一步研究。

通过系谱分析，‘衡5229’（L61）、‘泛麦5号’（L71）和‘衡 7228’（L80）的 Lr26 可能源于‘冀5418’［25－26］；‘百 农 AK58’（L72）和 ‘04 中 3604’（L115）的Lr26 可能源于‘周麦11’［26－27］；‘石4185’（L4）、‘京东8号’（L20）、‘淮麦20’（L23）、‘鲁麦1号’（L34）、‘陕229’（L35）、‘GS郑麦004’（L56）、‘河东 TX－006’（L81）和‘A3－5（L101）’的Lr26 分别来自‘洛夫林10’、‘洛夫林13’、‘山前麦’和‘牛朱特’等。‘石4185’（L4）、‘邯6172’（L45）、‘周麦16’（L45）、‘周麦18’（L70）、‘百农 AK58’（L72）和‘兰天14’（L85）这6个品种含有Lr26 与 Li［27］推导出的结果一致。

通过分子检测‘中梁26’可能含有抗叶锈基因Lr19，‘中梁26’在苗期对所有测试的28个小麦叶锈菌致病类型均表现高抗，其亲本组合中，‘Ciemenp’抗条锈、叶锈和秆锈，且抗白粉［28］，而‘8 W5015’为抗条锈品种，其他材料均不抗病（宋建荣，私人交流），因此Lr19基因可能来自于‘Ciemenp’。

关于Lr9的STS标记，已发表文献中有两种观点，一种是其可扩增出1 000 bp，如本研究Lr9 STS标记可从近等基因系Tc Lr 9扩增出1 000 bp DNA条带，与刘志勇等［29］和 Urbanovich等［30］报道片段大小相同；而另一种观点认为可扩增出1 100 bp特异性DNA条带，如Schacher mayr等［9］和 Tyryshkin 等［31］，图中虽可明确其大小与其他泳道中扩增的条带如Lr25有所不同，但仍需测序明确其准确数值。

4 结论

本研究构建的2个多重PCR体系稳定、可靠，能方便、准确地应用于分子标记辅助选择育种。任何育种目标都不仅仅是对单一性状的筛选，如果同时利用多种性状的分子标记辅助育种，如抗病基因和品质基因的分子标记辅助选择，可加快育种进程、缩短育种年限，提高效率，同时降低DNA提取的成本和工作量，从而使分子标记辅助选择（MAS）真正成为一种快速、有效、经济的育种方法。

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