刘婷婷， 殷幼平， 林亚玉， 贤家旭， 陈世伟， 王中康＊

（1．重庆大学生物工程学院基因研究中心，重庆 400030；2．广西利添生物科技发展 （合浦）有限公司，北海 536128）

柑橘黄龙病 （Citrus Huanglongbing，HLB）是影响世界柑橘产业的一种毁灭性病害［1］。该病害至今未能得到稳定的纯培养，妨碍了病害侵染机理的深入研 究［2］。Jeong－Soon Ki m［3］、Ute Albrecht［4］用生物芯片技术对柑橘染病后体内的基因表达进行了研究，从分子角度对柑橘被黄龙病菌侵染后的反应进行了分析。利用寄主抗病性是防治病害的一种经济有效的方法，国际对于柑橘的分子抗性育种也正在研究中［5］，但尚未有商用的抗性品种问世。依据现有的研究报道及田间观察，发现长期生长在柑橘黄龙病病区的多年生柚树（10～30年）病害症状不明显，对黄龙病呈现一定程度的耐病性，是抗黄龙病育种的潜在的基因资源，因此可以由此入手分析其抗病相关基因的特性。迄今为止，已经分离鉴定出约50余种抗病基因［6］，通过对这些基因进行分析，发现其表达产物具有特定的保守结构域，如核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）、亮氨酸重复序列（leucine－rich repeat，LRR）、丝氨酸／苏氨酸蛋 白 激酶（serine－threonine kinase，STK）等［7－8］。根据已知抗病基因表达产物的保守区域设计简并引物PCR扩增得到的序列称为抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs），目前通过该方法已经从甘蔗［9］、姜［10］、杏［11］、大豆［12］、小麦［13］等植物中扩增得到了大量RGAs。但是从基因组中得到的RGA可能有不表达的假基因，而从c DNA中分离的RGA则一般都是表达序列［14］，通过对已克隆RGA的分析，并不是所有的RGA都与抗病基因相关，因此需要对得到的RGA进行抗病相关性的分析和鉴别以确定抗病相关基因。基因的功能可以通过基因的表达特征反映出来，定量PCR是研究基因表达较为灵敏、快速、简单的方法，目前已经在各个研究领域得到了广泛的应用［15］。利用定量PCR技术，蔡高磊等［16］研究了小麦Ta OZR基因的表达情况，张薇等［17］对烟草激活蛋白Pea T1的诱导抗性作用进行了研究，杨立桃等［18］对转基因水稻外源基因拷贝数进行了分析。本研究利用较耐病的柑橘属柚c DNA为模板，根据植物抗病基因表达产物的保守区域设计简并引物扩增抗病基因相似序列，然后设计特异性引物，采用实时荧光定量PCR技术，验证抗性基因相似序列与黄龙病菌侵染的相关性，期望获得具有抗病基因保守区域的黄龙病抗性候选基因，为黄龙病抗性基因的克隆及抗病基因作用机制的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1．1 材料处理及RNA提取

供试植物为10年生琯溪蜜柚叶片（福建长泰）与奥林达夏橙（由广西合浦乌家柑橘种植场提供）。甜橙采取两组处理方式，一组嫁接黄龙病病芽（T），一组不嫁接作为空白对照（C），每组8棵植株。处理后的两组植物分别放于温室内培养，保持持续的自然光照射，温度为17～25℃。嫁接1个月后开始取样，每株取3片叶片，以后每个月取1次连续取8个月。每次取的样品洗净后液氮速冻后于－80℃冰箱保存。提取DNA，选取定量PCR检测为阳性的3株样品用于进一步试验。用Trizol法提取植物的总RNA，每组样品3个生物重复，RNase－free DNase I处理样品以排除DNA的污染，分光光度计检测样品，并于1．0%的琼脂糖凝胶上电泳检测RNA的完整性，A260nm／A280nm的比值在1．8～2．0之间的样品利用随机引物和M－MLV反转录酶合成c DNA第1链。

1．2 RGA的扩增及序列分析

根据抗性基因保守区利用Pri mer5．0设计简并引物（表1），以琯溪蜜柚c DNA为模板进行PCR扩增，产物于1．5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收、连接、转化，挑选阳性克隆酶切，筛选部分差异阳性克隆测序。序列输入Gen Bank进行Blast比对，ORF Finder用于寻找RGA的开放阅读框。推导的氨基酸序列与已克隆的NBS类抗性基因利用DNA MAN软件进行序列比对，寻找其保守区域，并利用Cl ustal x及MEGA4进行系统进化树的构建。

表1 PCR扩增所需引物1）

1．3 定量PCR表达分析

根据测序结果利用beacon designer 7．0设计特异性定量引物（表2），对甜橙c DNA进行扩增，经验证后的特异性引物进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系为25μL，其中包括 SYBGREEN Mix 12．5μL，10μmol／L引物各1μL，反转录产物2μL作为模板，每个样品3个技术重复，空白处理水为模板以排除污染。最后通过IQ5软件对数据进行分析。

表2 用于实时荧光定量PCR的引物

2 结果与分析

2．1 柚子c DNA RGA的克隆与序列分析

利用引物对柚c DNA进行扩增，将目的条带进行回收和克隆，通过RFLP筛选差异阳性克隆，共选取6个送去测序，分别命名为GJ10、GJ17、GJ20、GJ28、GJ31、GJ35，通过DNA MAN软件将序列与烟草N、亚麻L6、拟南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等基因进行多序列比对，发现除GJ17以外，其余5个序列与选取的R基因具有一致的NBS保守区（P－loop、kinase－2、GLPL 等）（图1），上传到 Gen Bank中，登录号为H M777043～HM777047。同时，序列分析显示其在氨基酸水平上的相似性为分别为32．52%、19．71%、28．41%、39．23%、42．86%。通过Clustalx，MEGA等软件进行进一步的系统分析，构建进化树（图2），如图所示5个RGAs与拟南芥RPS2、RPS5形成一个分支，拟南芥RPM1、RPP8和土豆I2C属于一个分支簇，亚麻L6和烟草N 属于一个分支簇。

2．2 定量PCR的表达分析

为确定得到的RGAs是否受黄龙病诱导而表达变化，采用实时荧光定量PCR技术分析其表达。根据得到的RGAs设计的特异性引物以甜橙c DNA为模板均能够得到扩增曲线，经克隆测序验证属于甜橙序列，因此可利用定量PCR方法研究黄龙病侵染过程中5个RGAs的表达情况。同时，根据本实验室石小刚博士的研究结果，GAPDH和NADH是分析柑橘黄龙病侵染过程中基因表达最合适的内参基因［19］。结果（图3）显示在嫁接病芽后8个月的连续采样中5个RGAs的表达受到不同程度的调控，GJ20和GJ31在试验组第2次采样中表达量大幅上升，而在嫁接病原前后的其余月份中表达相对比较稳定；GJ28在试验组第4次采样时表达上调，其余几个月表达趋于稳定；GJ35在嫁接病原后总体表达较对照组大幅度下调；GJ10在嫁接病原后3个月时表达下降，其余月份与对照组几乎达到平衡。

图1 克隆得到的5个RGAs推导的氨基酸序列与7个已知抗病基因NBS保守结构域的比对

图2 5个序列推导的氨基酸与已知物种抗病基因蛋白产物的系统进化树

3 讨论

由于黄龙病寄主植物通常树体大，生长周期长，很难通过传统方法克隆抗性基因，RGAs的分离鉴定及表达分析可以为抗性基因的克隆提供一定的线索，但是利用基因组DNA为模板扩增得到的RGA或许包含内含子，而从c DNA中得到的序列则是无终止子的编码序列。迄今为止，从柚c DNA中分离鉴定RGA仅见1篇报道［20］，他们以柚花柱c DNA为模板扩增得到了10个序列，但并未对其进行表达特性的研究分析。本试验从柚c DNA中成功获得5个RGAs，所得到的5个RGAs与7个已知的植物抗性基因的NBS保守区域具有高度相似性。然而，核苷酸结合位点（NBS）仅仅是植物抗性基因的一个保守区域，它不仅在抗性基因中存在，在ATP和GTP结合蛋白中也存在［21］。除了核苷酸结合位点（NBS），柚NBS－LRR类抗性基因还应具有其他的重要 结 构，例 如 TOLL、TIR（Interluken－1－receptor）或LRR（Leucine－rich repeats），因此所得到的5个RGAs只能作为抗性候选基因。

图3 接种黄龙病后5个RGAs的相对表达分析

为证实本研究得到的抗病同源基因是否为抗黄龙病相关基因，采用实时荧光定量PCR技术来观察其在黄龙病病原侵染过程中的表达是否发生变化，如果能被诱导进行上调或下调表达，则可能是抗病候选特异基因，参与病原侵染过程。由于柚感染黄龙病后相关症状表现并不十分明显，尤其是多年生的大树，甚至并不能被病原所感染。本试验嫁接柚多次未能得到感染株，遂利用得到全部感染病程的奥林达夏橙作为定量PCR的材料，因此试验结果或许会有些许差异。本试验中的5个RGAs经实时荧光定量PCR后，其表达量均有所变化，可以初步确定为抗病相关基因，但是其表达只是在特定时期发生微量变化，推测除了病原其表达可能同时也受其他因素的影响。其中GJ20和GJ31在接种后第2月表达量大幅度上升，其余月份表达稳定，根据黄龙病的生长情况推测其可能是因为在侵染初期病菌数量相对较少，对基因表达的诱导不强；而后病菌增殖，致使相关基因表达增强，又反过来抑制了病菌繁殖，使得基因表达下降并最终趋于稳定。GJ10、GJ28和GJ35的表达相对来说无明显的规律。根据表达情况，推测GJ20和GJ31较有可能与HLB菌的相关抗性基因相关，进一步的试验主要是通过获得其全长序列，构建表达载体，通过RNAi技术进一步验证，以确定其功能。

［1］ Bove J M．Huanglongbing：A destr uctive，newly－emerging，century－old disease of Citr us［J］．Plant Pat hology，2006，88（1）：7－37．

［2］ Wang Z K，Sun X Y，Yin Y P，et al．Comparison of PCR，DIA and pathogenicity assay for detection of Xanthomonas axonopodis pv．citri，the causal agentof citrus bacterial canker disease［J］．Agricultural Science in China，2004，3（6）：442－447．

［3］ Ki m J S，Sagara m U S，Bur ns J K，et al．Response of sweetorange（Citr us sinensis）to‘Candidatus Liberibacter asiaticus’infection，micr oscopy and microarray analyses［J］．Phytopat hology，2009，99（1）：50－57．

［4］ Al brecht U，Bowman K D．Gene expression in Citr us sinensis（L．）Osbeck f ollowing infection with the bacterial pat hogen Candidatus Liberibacter asiaticus causing Huanglongbing in Florida［J］．Plant Science，2008，175（3）：291－306．

［5］ Dutt M，Madhavaraj J，Gr osser J W．Agrobacteriu m t u mef aciens－mediated genetic transfor mation and plant regeneration fro m a co mplex tetraploid hybrid citr us r ootstock［J］．Scientia Horticult urae，2010，123：454－458．

［6］ Hulbert S H，Webb C A，Smit h S M，et al．Resistance gene co mplexes：evolution and utilization［J］．Annual Review of Phytopathology，2001，39：285－312．

［7］ Jones J D．Putting knowledge of plant disease resistance genes to work［J］．Current Opinion in Plant Biology，2001，4：281－287．

［8］ Dangl J L，Jones J D G．Plant pat hogens and integrated defence responses to infection［J］．Nat ure，2001，411：826－833．

［9］ Que Y X，Xu L P，Lin J W，et al．Isolation and characterization of NBS－LRR resistance gene analogs from sugarcane［J］．Acta Agron Sinica，2009，35（4）：631－639．

［10］Aswati N R，Tho mas G．Isolation，characterization and expression st udies of resistance gene candidates（RGCs）from Zingiber spp．［J］．Theoretical and Applied Genetics，2007，116：123－134．

［11］Soriano J M，Vilanova S，Ro mer o C，et al．Characterization and mapping of NBS－LRR resistance gene analogs in apricot（Pr unus ar meniaca L．）［J］．Theoretical and Applied Genetics，2005，110：980－989．

［12］Wang B J，Wang Y J，Wang Q，et al．Characterization of an NBS－LRR resistance gene ho mologue from soybean［J］．Journal of Plant Physiology，2004，161：815－822．

［13］Bozkurt O，Hakki E E，Akkaya M S．Isolation and sequence analysis of wheat NBS－LRR type disease resistance gene analogs using degenerate PCR pri mers［J］．Biochemical Genetics，2007，45：469－486．

［14］阙友雄，许莉萍，林剑伟，等．斑茅NBS－LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析［J］．热带作物学报，2009，30（2）：192－197．

［15］吴静，吴茂森，何晨阳．实时定量PCR的原理及其在植物病理学研究中的应用［J］．植物保护，2007，33（6）：123－128．

［16］蔡高磊，王晓杰，刘丹，等．条锈菌诱导的小麦Ta OZR的克隆及特征分析［J］．中国农业科学，2010，43（12）：2403－2409．

［17］张薇，杨秀芬，邱德文，等．激活蛋白Pea T1诱导烟草对T MV的系统抗性［J］．植物病理学报，2010，40（3）：290－299．

［18］杨立桃，丁嘉羽，张大兵，等．利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数［J］．中国食品卫生杂志，2005，17（2）：140－144．

［19］Shi X G，Hu X F，Yin Y P，et al．Reference gene selection for gene expression analysis in Huanglongbing infected sweetorange of citr us［J］．（sub mitted to BMC Molecular Biology）．

［20］黄代青，王平，吕柳新．柚c DNA中NBS－LRR类R基因同源序列的分离［J］．中国农业科学，2004，37（10）：1580－1584．

［21］Shirasu K，Schulze－Lefert P．Regulators of cell deat h in disease resistance［J］．Plant Mol Biol，2003，44：371－385．