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腺病毒介导siRNA抑制全反式维甲酸诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达

2012-02-26毕杨龚敏何昀张赟陈洁李廷玉

生物工程学报 2012年5期
关键词:维甲酸腺病毒阳性细胞

毕杨,龚敏,何昀,张赟,陈洁,李廷玉

重庆医科大学附属儿童医院 儿童营养研究中心 儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室,重庆 400014

全反式维甲酸 (All-trans retinoic acid,ATRA) 是目前公认的能有效诱导干细胞分化的重要因子,它是维生素A在体内的重要活性代谢产物,多项研究证实ATRA及其信号通路广泛参与了胚胎期和生后早期神经细胞分化、轴向对称生长等神经系统发育过程[1]。ATRA主要通过细胞核膜上的维甲酸受体 (Retinoic acid receptor,RAR) 介导信号转导,影响下游基因的转录调控从而发挥其生物学效应[2]。RARs包含由不同基因编码的α、β与γ 3个亚型,其中RARβ是一种在神经细胞特异表达的受体,对神经元表型的决定和维持有重要作用[3]。前期结果显示,骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells, MSCs) 中几乎不表达 RARβ,而 ATRA预处理可以增强RARβ的表达,促进骨髓间充质干细胞定向成神经分化[4],提示RARβ可能是维甲酸信号转导途径参与MSCs成神经分化的重要因素。siRNA沉默技术是研究信号转导通路的重要技术方法[5],本研究构建并筛选出携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,感染 MSCs后能有效抑制ATRA诱导的 RARβ表达增高,为进一步探讨RARβ是否参与维甲酸信号转导途径调控的MSCs成神经分化作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

腺病毒穿梭质粒pSES-HUS、携带腺病毒骨架质粒pAd-Easy1的大肠杆菌BJ5183 (美国芝加哥大学何通川教授馈赠);大肠杆菌 DH5α、HEK293细胞 (本实验室保存);大鼠MSCs为本实验室分离培养,内切酶SfiⅠ、PmeⅠ、PacⅠ(Biolabs公司);T4 DNA连接酶、RT-PCR试剂盒、PCR Premix、Real-time PCR Master Mix (TaKaRa公司);DNA marker、质粒抽提试剂盒(Promega公司);LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司);DMEM培养基、胎牛血清 (HyClone公司);兔抗大鼠RARβ多克隆抗体、兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶 (Neuron-specific enolase,NSE) 抗体 (Abcam 公司);羊抗大鼠巢蛋白(Nestin) 抗体、小鼠抗大鼠 β-微管蛋白(β-tubulin, Tju1) 抗体、小鼠抗大鼠 β-肌动蛋白(β-actin) 抗体、HRP标记的羊抗兔二抗 (Santa Cruz公司);Dylight488标记的羊抗兔、羊抗小鼠、驴抗羊二抗 (Jackson Immunor Research公司);PCR引物 (Invitrogen公司合成);基因测序由重庆医科大学感染病重点实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 pAd-siRARβ腺病毒载体的构建

设计 4对大鼠 RARβ基因的 siRNA序列(表1),体外退火 (10 mmol/ L各10 µL混合,100 ℃,10 min,自然冷却至室温) 成两端有SfiⅠ酶切位点的双链DNA,SfiⅠ酶切pSES-HUS质粒,与退火片段16 ℃连接4 h,连接产物电转大肠杆菌DH5α,卡那霉素抗性筛选单克隆,抽提质粒,PCR (反应体系20 µL∶2 µL质粒模板,330 mg/L siRNA反义链和 U6启动子引物各0.5 µL,2×反应液10 µL,加水至20 µL;PCR参数:94 ℃ 2 min ;94 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,72 ℃20 s,30个循环;72 ℃ 2 min ) 鉴定后并送测序,获得 4组 pSES-siRARβ质粒。PmeⅠ酶切pSES-siRARβ质粒将其线性化,纯化后转化入携带pAd-Easy1骨架质粒的BJ5183感受态细胞内进行同源重组,卡那霉素和链霉素筛选,PCR (引物及条件同前) 和以pAd-Easy1为对照的PacⅠ酶切鉴定获得腺病毒质粒pAd-siRARβ。

表1 大鼠RARβ的siRNA序列Table 1 Sequences of siRNA for rat RARβ

1.2.2 重组腺病毒在 HEK293细胞中包装并感染大鼠MSCs

将 PacⅠ酶切线性化的重组腺病毒质粒pAd-siRARβ用脂质体转染 HEK293细胞,每隔3 d在倒置荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(Red fluorescent protein, RFP) 的表达变化及细胞状态。继续培养10~14 d,离心收集漂浮及贴壁细胞,1 mL PBS重悬,-80 ℃/37 ℃反复冻融4次,离心取上清,反复感染HEK293细胞数次获得高滴度病毒。计算病毒滴度公式:病毒滴度(PFU/mL) =RFP阳性细胞数×病毒液稀释倍数(PFU) /稀释后体积 (mL)。MSCs按2×105细胞/孔接种 6孔板中,用 10、20、40、80感染复数(MOI: 病毒颗粒/MSCs) 的腺病毒感染,48 h后在荧光显微镜下计数RFP阳性细胞百分率,计算病毒的最佳MOI。

1.2.3 Real-time PCR筛选4组siRNA对ATRA诱导的RARβ表达的抑制效率

MSCs按2×105细胞/孔接种6孔板中,待细胞贴壁后分别用 4组 Ad-siRARβ重组腺病毒感染,同时设置空白对照组及Ad-RFP腺病毒对照组,病毒感染3 d后加入1 µmol/L ATRA处理24 h,提取各组细胞的mRNA,反转录成cDNA模板,用能特异扩增大鼠RARβ的引物 (表2) 进行Real-time PCR扩增 (PCR反应体系20 µL:2 µL cDNA模板,330 mg/L引物各 0.5 µL,2×SYBR Green反应液10 µL,加水至20 µL;PCR参数:94 ℃ 3 min ;94 ℃ 10 s,54 ℃ 20 s,72 ℃20 s,40个循环;溶解曲线 65 ℃ ~ 95℃ 每5 s增加0.5 ℃,读板),同时以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参平行管。将筛选出的有效果的 3组Ad-siRARβ腺病毒等摩尔比例混合设为pool组,同上方法检测对 RARβ的抑制效果。后续实验siRARβ组均为3种有效Ad-siRARβ腺病毒混合感染细胞。

表2 Real-time PCR引物Table 2 Primers for Real-time PCR

1.2.4 Western blotting及免疫荧光检测siRARβ pool对ATRA诱导的MSCs的RARβ表达的抑制效果

在 6孔板中设置对照组、ATRA组、Ad-RFP+ATRA组及Ad-siRARβ pool+ATRA组,提取总蛋白,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,每组蛋白上样量一致,80 V转膜1 h至PVDF膜。用5%脱脂奶粉室温封闭1~2 h,加入抗RARβ抗体(1∶200) 或β-actin抗体 (1∶200),4 ℃过夜;洗膜,加入HRP标记的二抗 (1∶2000),室温30 min;ECL发光,用Image Pro Plus 6.0软件分析灰度值。在24孔板中同上设置各组,吸弃培养基,PBS洗涤1次,加500 µL甲醇/孔,-20 ℃固定15 min;5%牛血清白蛋白500 µL/孔,室温封闭1 h;兔抗大鼠RARβ抗体 (1∶500稀释于PBS) 4 ℃摇动孵育过夜;Dylight488标记的羊抗兔二抗 (1∶1 000稀释于PBS) 室温摇动孵育30 min;PBS 洗涤5 min,重复3次,立即置于倒置荧光显微镜下观察照相,Image J软件测定荧光强度值。

1.2.5 Real-time PCR及免疫荧光检测 siRARβ对ATRA诱导的MSCs神经分化的影响

MSCs按2×105细胞/孔接种6孔板中,待细胞贴壁后用 Ad-siRARβ pool重组腺病毒感染,同时设置MSCs对照组、ATRA处理对照组及Ad-RFP腺病毒对照组,病毒感染3 d后加入1 µmol/L ATRA处理24 h,弃去完全培养基,D-hank’s液洗细胞2次,加入改良神经诱导培养基 (Modified neuronal induction medium,MNM) (含2%二甲亚砜,200 µmol/L丁基羟基茴香醚,20 mmol/L KCl,1.6 mmol/L丙戊酸,8 µmol/L福斯高林,0.8 µmol/L氢化可的松,4 ng/L胰岛素的DMEM/F12无血清培养基) 诱导细胞24 h。提取各组细胞的mRNA,反转录成cDNA模板,Real-time PCR检测特异性神经标志物 Nestin、NSE、微管相关蛋白 2 (Microtubule-associated protein 2, MAP-2)、Tau蛋白的表达 (引物见表 2,方法同1.2.3)。在24孔板中同上设置各组,同1.2.4方法检测神经标志物Nestin、NSE及Tju1的表达。实验重复3次,每次随机选取10个非重叠视野,计数阳性细胞占总细胞的百分率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 pAd-siRARβ腺病毒载体的构建

4组pSES-siRARβ质粒经上述引物PCR可扩出约300 bp的条带,测序结果与所设计的siRNA序列完全一致。同源重组后的pAd-siRARβ质粒PCR同样可获得约300 bp的条带,PacⅠ酶切质粒可见4 500 bp的特征性小片段和大于30 kb的大片段 (图1),表明重组腺病毒质粒pAd-siRARβ构建成功。

2.2 重组腺病毒在 HEK293细胞中包装并感染大鼠MSCs

pAd-siRARβ质粒经 PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,24 h可观察到约10%~20%细胞有RFP的表达,10 d可见RFP阳性细胞呈现云雾状聚集,细胞变圆有病毒空斑形成,待1/2以上细胞脱壁漂浮时收集病毒液,数次感染HEK293细胞,最终得到的4个重组腺病毒滴度在 (4.5×108~7.0×108) PFU/mL范围。重组腺病毒感染大鼠MSCs的RFP阳性率在60%~70%时,MOI分别为20、20、40、20 (图2)。

2.3 Real-time PCR筛选siRNA对RARβ表达的抑制效率

ATRA 处理可显著增强 RARβ的表达16.5±2.34倍(P<0.05),4组 Ad-siRARβ处理后ATRA诱导 MSCs的 RARβ表达量分别下降了(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%、(-19.1±1.24)%。将有抑制效果的前3组Ad-siRARβ混合为pool后,对RARβ的抑制效率明显增强,表达量下降 (78.09±4.24)% (P<0.01) (图3)。

图1 pAd-siRARβ腺病毒载体的构建鉴定Fig. 1 Construction of four pairs of pAd-siRARβ adenovirus recombinant. M1: DNA marker1 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp; M2: λ /Hind III DNA marker 23 130 bp, 9 416 bp, 6 557 bp, 4 361 bp, 2 322 bp, 2 027 bp, 564 bp, 125 bp, 1: pSES-siRARβ 1 U6+site1 anti-sense PCR; 2: pSES-siRARβ 2 U6+site2 anti-sense PCR; 3: pSES-siRARβ 3 U6+site3 anti-sense PCR; 4: pSES-siRARβ 4 U6+site4 anti-sense PCR; 5: pAd-siRARβ 1 U6+site1 anti-sense PCR; 6: pAd-siRARβ 2 U6+site2 anti-sense PCR; 7: pAd-siRARβ 3 U6+site3 anti-sense PCR; 8: pAd-siRARβ 4 U6+site4 anti-sense PCR; 9: pAd-siRARβ 1 PacⅠ; 10: pAd-siRARβ 2 PacⅠ; 11: pAd-siRARβ 3 PacⅠ; 12: pAd-siRARβ 4 PacⅠ; 13: pAd-Easy1 PacⅠ.

图2 Ad-siRARβ腺病毒在HEK293细胞中包装及感染大鼠MSCs (以Ad-siRARβ 1为例)Fig. 2 Package of Ad-siRARβ in HEK293 cells and infection of rat MSCs (take Ad-siRARβ 1 as example). (A) pAdsiRARβ 1 transfected HEK293 cells at 1 d. (B) pAd-siRARβ 1 transfected HEK293 cells at 10 d. (C) Ad-siRARβ 1 infected MSCs at 2 d.

图3 不同处理组RARβ的表达水平Fig. 3 The expression of RARβ in each treated groups. △: P<0.05 compared with control group; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ATRA group; **: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA group.

2.4 siRARβ可抑制 ATRA诱导的 MSCs RARβ表达增高

对照组MSCs中几乎无RARβ表达,ATRA处理24 h后的MSCs有较强的RARβ蛋白表达,并定位于细胞核 (图4、5),Ad-RFP腺病毒感染不影响RARβ的表达及定位变化,Ad-siRARβ组ATRA诱导的RARβ表达明显降低 (P<0.05)。

2.5 siRARβ可抑制ATRA诱导的MSCs神经分化

MSCs中仅有少量的Nestin表达,ATRA联合MNM培养可诱导MSCs向神经分化,分化24 h后表达Nestin、NSE、MAP-2及Tau特异性神经细胞标志 (图7),免疫荧光结果显示Nestin、NSE、Tju1阳性细胞比例为 (50.37±5.01)%、(85.45±6.78)%、(88.02±15.37)% (表3)。siRARβ组相关神经标志物的表达降低,Nestin、NSE、Tju1阳性细胞比例分别为 (38.94±4.26)%、(21.39±5.19)%、(27.79±6.54)%,差异有统计学意义 (P<0.01)。提示腺病毒介导的siRARβ可显著抑制ATRA+MNM诱导的MSCs神经分化。

图4 Western blotting检测Ad-siRARβ对ATRA诱导的RARβ表达的抑制Fig. 4 Western blotting was performed to detect the inhibition efficiency of Ad-siRARβ to ATRA induced RARβ expression. 1: control group; 2: ATRA group; 3: Ad-RFP+ATRA group; 4: Ad-siRARβ+ATRA group. n=3; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ATRA group.

图5 免疫荧光检测各处理组RARβ定位及表达变化Fig. 5 Localization and expression change of RARβ in each group were detected by immunofluorescence (200×). n=5; *: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA group. (A) Immunofluorescence staining. (B) Immunofluorescence intensity.

图6 不同诱导组神经特异性标志物的的表达水平Fig. 6 Expression of neural specific markers in each induced groups. n=3; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ ATRA+MNM group; **: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA+MNM group.

表3 免疫荧光检测各神经特异性标志蛋白的阳性细胞比例(±s)Table 3 Positive expression ration of neural specific markers of induced neural cells by immunofluorescence (±s)

表3 免疫荧光检测各神经特异性标志蛋白的阳性细胞比例(±s)Table 3 Positive expression ration of neural specific markers of induced neural cells by immunofluorescence (±s)

n=10; *: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA+MNM group.

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3 讨论

全反式维甲酸在生物个体发育及维持正常生理状态中有重要作用,可介导对细胞的分化、增殖、凋亡和免疫调节等多种生物学功能[6]。ATRA也是诱导神经板生成的重要生物活性物质,能促进多潜能神经嵴前体细胞的生存、增殖及诱导其向神经元分化[7]。骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新及跨胚层分化能力的成体干细胞,在特定诱导环境下可分化为神经样细胞,移植动物可在中枢神经系统存活并分化为有一定功能的神经样细胞[8]。本课题组前期研究发现:ATRA预诱导可显著提高MSCs向神经样细胞的转化及存活率[4],并有效改善MSCs对新生大鼠缺氧缺血性脑病的移植治疗效果[9]。

ATRA主要通过维甲酸受体RAR (包括α、β、γ 3个亚型) 介导信号转导,影响下游基因的转录调控[10],其信号调控的多样性取决于组织细胞类型、背景及维甲酸信号通路相关因子的表达状态。ATRA可通过调控RAR亚型的表达,导致神经管的发育缺陷,提示RAR的表达模式与神经管的发育密切相关,其中RARβ表达的上调是实现神经管后孔关闭的必要因素[11]。Goncalves MB等[12-13]发现RARα激活状态下,神经祖细胞主要分化为星形胶质细胞和少突神经胶质细胞,而RARβ激动主要诱导神经元的形成,并上调神经发育重要转录因子islet-1/2的表达,提示RARα调节神经胶质细胞的分化,而RARβ决定神经元表型。我们前期检测到大鼠原代MSCs中RARα、RARγ有低水平的表达,而 RARβ几乎不表达,MSCs神经诱导过程中各RARs表达均有不同程度上调,细胞向神经元及神经胶质细胞方向分化。而ATRA预诱导促进MSCs向神经元转化,抑制胶质细胞分化,经不同浓度 (0.01、0.1、1 μmol/L) ATRA处理24 h后RARα、RARγ表达没有变化,而RARβ表达显著增高,且具有明显的量效关系[3]。因此我们认为ATRA可能通过上调RARβ激活维甲酸信号途径,促进MSCs向神经方向分化及神经元表型的决定。

为了证实这一假设,我们拟采用siRNA抑制ATRA处理后MSCs中RARβ的表达,以便进一步研究RARβ对维甲酸信号转导途径促MSCs成神经分化的影响及具体的分子机制。腺病毒介导siRNA表达是目前基因工程领域常用的技术手段[14], 在本实验中,我们选择带有U6和H1双启动子的siRNA构建系统[15],构建了4组携带针对大鼠RARβ的siRNA腺病毒,感染MSCs能达到60%以上的高效率,并从中筛选出3组能有效抑制RARβ内源性表达的siRNA。由于siRNA具有序列相似性,可能抑制其他具有相似位点的基因表达,为了尽可能地减少这种脱靶(off-target) 效应[16],我们采用混合池 (pooling)的策略,即用等比例的不同位点siRNA混合。因为3组siRNA均是针对RARβ这一靶基因,但是off-target的非特异性位点却不一样,从而减小了off-target几率,而混合后siRNA的knockdown效率却等同于、甚至超过单独siRNA效率的加和[17]。我们的结果也显示,pool组的抑制效率明显高于各个单独siRNA组。

随后,我们检测了siRARβ对MSCs神经分化的影响。MSCs仅表达少量神经干细胞标志Nestin,ATRA预诱导联合MNM神经诱导是本实验室诱导MSCs体外神经分化的成熟模型[18],诱导后细胞折光性增强,并逐渐伸出突起,呈双极或多极神经元细胞形态,神经元早期及特异性标志蛋白 NSE、Tju1[19],神经元树突标志物MAP-2,神经元轴突标志物Tau蛋白[20]的表达显著增高。siRARβ抑制RARβ的表达,从一定程度上阻断了ATRA与RARβ结合后导致的维甲酸信号转导途径的级联放大反应,减少了与目的基因启动子区域的特异性 RAR顺式作用元件(RARE) 结合,抑制神经发育相关基因的转录。然而,我们发现siRARβ组ATRA联合MNM诱导的神经蛋白的表达水平,低于MNM单独诱导,可能的原因在于腺病毒介导的siRARβ,不仅抑制了ATRA诱导的RARβ表达增高,在MSCs整个体外诱导过程中,包括 MNM神经诱导阶段,siRNA的knock-down效应仍然有影响。因此,在后续的研究中,可能需要采用RARβ的特异性抑制剂LE135[21],阶段性地抑制RARβ活性。

本实验成功构建并筛选出了针对大鼠 RARβ的siRNA腺病毒,并在大鼠MSCs中证实其能有效抑制ATRA诱导的RARβ内源性表达增高,同时抑制MSCs的体外神经分化。为深入研究RARβ对维甲酸信号转导途径在MSCs成神经分化中的作用及具体分子机制提供了重要的实验基础。

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