秦俊哲， 郭云霞

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

银杏茶是由银杏叶加工而成，含有黄酮、萜内酯等有效成分，对心脑血管疾病的防治有显著功效[1,2].但是银杏茶中还含有对人体有害的成分银杏酸[3]，它是6-烷基或烯基水杨酸的衍生物[4]，具有致敏性[5,6]、细胞毒性[7,8]和免疫毒性等作用[9],其食用安全性已引起了人们的高度重视.国外对银杏提取物中的银杏酸含量有限量标准，但对银杏茶中银杏酸的限量及检测方法还没有统一的标准.2010年国家质监局将银杏茶确定为保健食品，因此建立银杏茶中银杏酸的快速有效的检测方法势在必行.本文选用银杏茶为原料，建立了快速、准确的银杏酸薄层层析-紫外分光光度检测方法，为银杏茶的质量监控和安全性评价提供了依据.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

银杏茶,市售.标准品:银杏酸A(C15:0,C17:1),银杏酸B(C13:0,C15:1,C17:2)，中国药品生物制品检定所，编号111594-200502.硅胶G,青岛海洋化工厂.正己烷、甲醇、石油醚等均为分析纯.SP-752型紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司.BF-2002高效液相色谱仪, 北分瑞利分析仪器有限责任公司.

1.2 方法

1.2.1 展开剂的确定

根据展开剂选择的原则[10]，选出几种展开剂进行试验，直至选出能分离银杏酸的展开剂.

1.2.2 银杏酸样品溶液的制备

称取适量银杏茶粉，经正己烷索氏提取、乙醇萃取去除杂质，收集正己烷提取溶液于40 ℃减压浓缩至干，用正己烷定容至10 mL，采用微量注射器吸取0.5 mL在薄层板上进行条状点样.展开剂展开后，置于三用紫外仪254 nm下，选取与标准品Rf值相同的蓝色荧光部分物质进行甲醇洗脱，定容至10 mL，微孔滤膜过滤得到样品溶液.

1.2.3 银杏酸的HPLC分析

色谱分析条件：色谱柱为BF-2002，流动相为甲醇-1% HAc溶液(88∶12)，流速为1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长310 nm，进样量20 μL.

测定方法：准确称取一定银杏酸A与银杏酸B分别用甲醇溶解定容至25 mL，相同浓度下银杏酸A与银杏酸B以1∶2的体积比混匀，得总银杏酸对照品溶液.分别吸取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL用无水甲醇定容至5 mL的容量瓶，配制成系列梯度的银杏酸标准溶液，微孔滤膜过滤后上机进样分析，绘制标准曲线，取上述样品溶液进样分析.

1.2.4 银杏酸紫外分光光度法分析

准确称取一定银杏酸A与银杏酸B分别用甲醇溶解定容至25 mL，相同浓度下银杏酸A与银杏酸B以1∶2的体积比混匀，得总银杏酸对照品溶液.分别吸取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL用无水甲醇定容至5 mL的容量瓶.紫外扫描作定性分析，选择合适的吸收峰测定吸光度A，以银杏酸浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，线性回归得标准曲线方程.取上述样品溶液在最大吸收波长处测定吸光度，带入标准曲线方程计算银杏酸含量.

2 结果与讨论

2.1 展开剂的确定

比较各种展开剂的展开效果，表明以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(冰醋酸)=18∶1∶1为展开剂，分离度好，无拖尾，展开时间为15 min，银杏酸在253.7 nm紫外灯下显蓝色荧光，经测定计算比移值Rf=0.61.

2.2 HPLC法测定银杏酸含量

如图1所示，薄层色谱纯化后的银杏酸提取液，经HPLC面积归一化法后测定纯度约为98.3%，谱图中除银杏酸峰外，几乎没有杂峰出现，这是紫外分光光度法能用于定量分析银杏酸的理论依据之一.银杏茶中含有5种银杏酸，分别为C15:0、C17:1、C13:0、C15:1、C17:2，1～5的银杏酸分别为C13:0、C15:1、C17:2、C15:0、C17:1.试验测得银杏茶中银杏酸的得率分别为0.825 0%、0.835 8%、0.857 3%、0.831 1%，平均值0.837 3%.

2.3 紫外分光光度法测定银杏酸含量

2.3.1 测定波长的选择

将1.2.4中的对照品溶液在200～400 nm下进行扫描，以无水甲醇作为参比溶液，得银杏酸的最大吸收波长为307 nm,如图2所示,因此选用此波长为比色分析的波长.

图1 银杏酸的高效液相色谱图 图2 银杏酸的扫描图谱

2.3.2 标准曲线的绘制

在波长307 nm处测定，以银杏酸浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，线性回归得标准曲线方程：A=8.715C+0.040 7，R2=0.999 4，线性范围为：0.009～0.093 mg/mL,如图3所示.

2.3.3 稳定性试验

以无水甲醇为参比，将对照品溶液进行时间扫描，扫描间隔为2 s，由图4可见在30 min内吸光度稳定，所以检测数据稳定，可靠性强.

图3 总银杏酸标准曲线 图4 银杏酸时间稳定性考察

测定次数12345银杏酸得率/%0.840 10.855 60.888 90.861 10.848 9平均值/%0.858 9RSD/%2.15

表2 加标回收率试验

2.3.4 精密度试验

将同一银杏茶试样按1.2.2中方法处理，在307 nm下进行紫外检测，连续测定5次，其RSD=2.15，表明该方法具有良好的精密度，如表1所示.

2.3.5 加标回收率试验

采用加标回收法，按试验条件展开、测定，平均回收率为101.90%，表明本方法具有较高的准确度,如表2所示.

2.3.6 与高效液相法比较

样品经索氏提取，然后用乙醇萃取、薄层纯化后，经HPLC测定银杏酸得率为0.83%，UV在307 nm处测定为0.86%，相对误差为3.61%，因此紫外分光光度法可较准确地测定银杏酸的含量.

3 结束语

试验研究表明,采用薄层层析-紫外分光光度法分析银杏茶中银杏酸，准确度较高、线性范围宽、可较准确地测定银杏酸的含量.相对于高效液相色谱法，薄层层析-紫外分光光度法是一种检测分析银杏茶中银杏酸含量更简便、快速、测定成本低、易推广的方法.

参考文献

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[2] 张育松,陈洪德.银杏茶的的保健与制造[J].中国茶叶加工,2001,(2):21-27.

[3] 吴向阳,仰榴青,陈 钧. 银杏茶中有毒成分银杏酸的研究[J].分析化学, 2003,11 (31):1 407.

[4] 蔡德山.银杏叶药物市场分析[J].经济与市场,2009,3(2):7-13.

[5] 杨小明,陈 钧.烷基酚酸的生物活性研究进展[J].中草药,2003,34(5):5-6.

[6] Westendorf J,Regan J. Induction of DNA strand-breaks in primary rat hepatocytes by ginkgolic acids[J].Pharmazie,2000,55(11):864-865.

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[9] 刘 新,饶海丽.银杏叶制剂中毒性物质-银杏酸[J].内蒙古中医药,2008，(3):45-46.

[10] 马广慈,唐任寰,郑斯成.药物分析方法与应用[M].北京：科学出版社,2000:554-558.