马艳华，苏 波，向姝霖，姜 浩，杨邦敏，章 硕，夏 红，苏 琦

(南华大学1.附属第一医院，2.肿瘤研究所，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南衡阳 421001)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。我国胃癌死亡率占恶性肿瘤死亡的23.2%，为欧美国家的4.2～8.0倍，患者就诊时大多已经发生侵袭转移，因而手术、化疗、放疗疗效差，5年生存率低(发达国家33%，发展中国家20.5%)［1－2］。因此，开发有效、低毒的肿瘤侵袭转移抑制剂，对提高胃癌5年生存率具有重要的意义。

研究表明［3］，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的一种脂溶性有效成分，具有抑制多种恶性肿瘤细胞增殖的作用。本实验室已经证明，DADS可在体内外明显诱导人胃癌细胞增殖抑制与分化，其机制与降低ALP比活性与Con A凝集率，增加与重组细胞骨架蛋白合成，恢复细胞间缝隙连接通讯功能，阻滞细胞于G2/M，调节ATR/Chk1/ Cdc25C/cyclin B1、激活p38、抑制ERK/AP-1，上调组蛋白乙酰化、p21 WAF1等有关［4－8］。并且，我们在DADS抑制人胃癌细胞增殖的蛋白质组学研究发现LIMK1明显下调［9］。本研究在前期工作的基础上，探讨DADS对LIMK1表达在胃癌MGC803细胞迁移侵袭中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞 人胃癌MGC803细胞系南华大学肿瘤研究所保存。培养于10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2的恒湿培养箱中，2 d传代1次。

1.2 试剂与配制 DADS:Fluka公司产品，纯度80%，与Tween80以1∶2的比例充分溶解，加入体积分数为0.90的生理盐水稀释100倍，作为母液保存于－20℃冰箱中。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI 1640培养基(Gibco公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT试剂盒(Invitrogen公司)，PCR试剂为Promega公司产品。BCA蛋白定量检测试剂盒(Pierce公司)，ECL发光检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，胰蛋白酶Amresco公司产品，LIMK1(ab39641)rabbit polycloncial antibody、β-actin为美国ABCAM公司产品。

1.3 划痕试验 将2×106个MGC803细胞接种在6孔板，培养至90%融合状态，无血清培养液洗3次，加入新鲜无血清培养基;10 μl Eppendorf Tip在细胞板上划痕，无血清培养液洗3次，加入新鲜无血清培养基;加入不同浓度DADS，37℃，5%CO2培养箱，测量0 h、24 h的划痕距离，计算平均值与标准差，实验重复3次。

1.4 Transwell侵袭实验 采用孔径8.0 μm的Transwell(3428型)(Corning公司)。基质胶准备:将冻存于－80℃冰箱的matrigel(BD公司)4℃过夜，变成液态;无血清培养基以1∶9稀释，吸50μl均匀铺到Transwell上室，37℃过夜，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。在上室中加入100 μl预温的无血清的DMEM培养基，室温孵育30 min，使基质胶再水化，吸去剩余培养液，消化细胞，无血清培养基洗3次，调整细胞密度为1×109个·L－1;取细胞悬液100 μl加入上室，下室加入500 μl完全培养基;37℃、5%CO2孵育24 h，弃培养基，用棉签轻轻擦拭上室细胞;取出Transwell用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定细胞10 min，倒置，风干;加入0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗3次，棉签擦净上室细胞;倒置显微镜随机计数10个视野的细胞数，取均数。每组细胞设3个复孔，实验重复3次。侵袭抑制率/%=［(对照组穿膜细胞数－处理组穿膜细胞数)/对照组穿膜细数］×100%。

1.5 RT-PCR Total RNA Kit提取细胞总RNA，在AMV酶作用下逆转录合成 cDNA。设计并合成PCR引物序列:β-actin:F 5'-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG-3'，R 5'-ATG ATG GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3'，扩增片段367 bp; LIMK1:F5'-GGGGCATCATCAAGAGCA-3'，R5'-TGA GGGTGTTGACGGACC-5'，扩增片段138 bp。LIMK1反应条件:94℃5 min;94℃ 30 s，52.3℃ 30 s，72℃1 min，进行35个循环;72℃10 min。β-actin反应条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55.0℃ 30 s，72℃ 1 min，进行35个循环;72℃10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，BIO-RAD凝胶成像系统拍照，AlphaImager 2200软件扫描，相对光密度(ROD)代表基因表达丰度，以LIMK1/β-actin表达丰度计算平均光密度值。

1.6 Western blot 分别收集细胞，冰PBS洗2次，1×107个细胞加入100～150 μl裂解液(100 mmol· L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol· L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg· L－1PMSF)，冰上裂解1 h，12 000 r·min－1离心10 min，吸出上清液，即细胞总蛋白。Bradford法测定蛋白质含量，分光光度计在570 nm波长处测定光吸收值，以溶剂为空白对照，牛血清白蛋白为标准绘制曲线，依据标准曲线推算蛋白质含量。收集蛋白，变性后，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含0.1%Tween-20)封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定光密度值。

1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件One-Way ANOVA或t检验进行统计学处理。

2 结果

2.1 DADS抑制人胃癌MGC803细胞增殖 Fig 1所示，30 mg·L－1DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后，其抑制率分别为 31.8%、66.1%、83.6%与89.2%(P＜0.05)。表明DADS可呈时间依赖性明显抑制人胃癌MGC803细胞增殖。

Fig 1 Effect of DADS on the proliferation of MGC803 cells *P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

2.2 DADS对人胃癌MGC803细胞迁移能力的影响 Fig 2、3所示，DADS未处理与处理的MGC803细胞在0h划痕距离较一致，10、20、30、40、50 mg· L－1DADS作用24 h后，细胞的划痕距离明显减少，表明MGC803细胞具有较强的迁移能力。而处理组较未处理组呈浓度依赖性划痕距离明显增加，表明DADS可抑制人胃癌MGC803细胞迁移。

2.3 DADS对人胃癌MGC803细胞侵袭能力的影响 Fig 4，5所示，10、20、30、40、50 mg·L－1DADS作用MGC803细胞24 h后，穿过基质胶的细胞数分别为(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)个，明显少于对照组细胞数(39.5±2.99)个(P＜0.05)。结果表明，DADS可浓度依赖性降低人胃癌MGC803细胞的体外侵袭能力。

Fig 2 Effect of DADS on the migration of MGC803 cells(×4)

Fig 3 Effect of DADS on the migration of MGC803 cells

Fig 4 Effect of DADS on the invasion of MGC803 cells(×200)

Fig 5 Effect of DADS on the invasion of MGC803 cells

2.4 DADS对人胃癌MGC803细胞LIMK1表达影响 RT-PCR显示，30 mg·L－1DADS处理MGC803细胞48h后，LIMIK1 mRNA明显下降(P＜0.05)(Fig 6)。表明DADS在mRNA水平上可以抑制LIMK1表达。

Fig 6 Effect of DADS on LIMK1 mRNA expression in MGC803 cells

Fig 7 Effect of DADS on the expression of LIMK1 in MGC803 cells by Western blot

3 讨论

肿瘤细胞的迁移侵袭行为是发生转移最关键的因素，明确肿瘤细胞的迁移侵袭机制，抑制肿瘤细胞的迁移侵袭能力已成为近年来研究的热点。

本研究显示，30 mg·L－1DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后，其抑制率分别为31.8%、66.1%、83.6%与89.2%，表明DADS可呈时间依赖性抑制人胃癌MGC803细胞增殖(P＜0.05)。10、20、30、40、50 mg·L－1DADS作用24 h后，细胞的划痕距离明显减少，穿过基质胶的细胞数明显少于对照组(P＜0.05)，表明DADS可呈浓度依赖性降低MGC803细胞的迁移侵袭能力。

研究证明，LIMK1在多种恶性肿瘤细胞内高表达或活性增强，并通过不同机制和途径参与肿瘤的侵袭转移过程。LIMK1基因位于人类染色体上7q11.23，全长39 499个 bp，编码 LIMK1蛋白。LIMK1可磷酸化Cofilin/ADF蛋白第3位的丝氨酸，磷酸化后其解聚肌动蛋白的能力消失，肌动蛋白聚合形成伪足结构，驱动肿瘤细胞迁移。因此，LIMK1对cofilin磷酸化与去磷酸化间的平衡进行微调节可能是影响肿瘤细胞迁移侵袭能力的决定性因素［10］。LIMK1的活性受多种蛋白调控，调节其活性的上下游的信号分子单独或联合LIMK1参与肿瘤细胞的侵袭迁移，主要受Rho-ROCK/PAK-LIMK-ADF/Cofilin信号通路调控。上调LIMK1活性的正调节蛋白包括Rac1、ROCK与PAK1、4，可使第508位的苏氨酸残基磷酸化而激活激酶［10－11］。许多癌基因通过调节LIMK的活性实现肿瘤细胞的迁移侵袭，如PKC zeta通过影响LIMK调节细胞骨架重组，促进人恶性胶质瘤细胞的迁移。VEGF通过MAPK途径调节LIMK1的活性，影响肌动蛋白重组及血管内皮细胞的迁移［12］。此外，许多抑癌基因通过下调LIMK1发挥其抑癌活性。如p57通过控制LIMK1活性减少肌动蛋白周转率，影响肿瘤细胞的迁移能力，发挥其抑癌作用［13］。近来，我们发现LIMK1在胃癌中表达明显高于正常组织与非典型增生组织，并随分化程度降低而增强，瘤体积≤3.0 cm的胃癌表达明显低于＞3.0 cm，淋巴结转移明显高于未转移组，TNM分期Ⅰ、Ⅱ期表达明显低于Ⅲ、Ⅳ期。提示LIMK1与胃癌的发生、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移以及临床分期密切相关［14］。并且证明DADS可抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭，其机制与下调LIMK1有关［15］。

本研究RT-PCR显示，30 mg·L－1DADS处理MGC803细胞48 h后，LIMIK1 mRNA明显下降(P＜0.05)，表明 DADS在 mRNA水平上可抑制LIMK1表达。同样，Western blot结果证明，LIMK1蛋白表达明显下调(P＜0.05)，表明DADS可抑制MGC803细胞LIMK1蛋白表达。

综上所述，DADS可明显抑制人胃癌MGC803细胞迁移侵袭，可能与下调LIMK1表达有关。本研究为寻找抑制肿瘤细胞侵袭、转移的作用靶点提供了依据。但 DADS是否通过 Rac1-Rock1/Pak1-LIMK1通路调控ADF/cofilin，抑制人胃癌细胞迁移与侵袭，其分子机制尚待进一步研究。

［1］ 孙秀娣，牧 人，周有尚，等.中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测［J］.中华肿瘤学杂，2004，26(1):4－9.

［1］ Sun X D，Mu R，Zhou Y S，et al.Analysis of mortality rate of stomach caner and its trend in twenty years in China［J］.Chin J Oncol，2004，26(1):4－9.

［2］ Parkin D M，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74－108.

［3］ Powolny A A，Singh S V.Multitargeted prevention and therapy of cancer by diallyl trislfide and related Allium vegetable-derived organosulfur compounds［J］.Cancer Lett，2008，269(2):305－14.

［4］ Yuan J P，Wang G H，Ling H，et al.Diallyl disulfide-induced G2/M arrest of human gastric cancer MGC803 cells involves activation of p38 MAP kinase pathways［J］.World J Gastroenterol，2004，10(18):2731－4.

［5］ 向姝霖，肖晓岚，凌 晖，等.二烯丙基二硫对人胃癌细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用［J］.癌症，2005，24(8):940－4.

［5］ Xiang S L，Xiao X L，Ling H，et al.Antitumor effect of diallyl disulfide on human gastric cancer MGC803 cells xenograft in nude mice［J］.Chin J Cancer，2005，24(8):940－4.

［6］ Ling H，Zhang L Y，Su Q，et al.Erk is involved in the differentiation induced by diallyl disulfide in the human gastric cancer cell line MGC803［J］.Cell Mol Biol Lett，2006，11(3):408－23.

［7］ 凌 晖，陆丽峰，文 玲，等.RNA干扰Chk1/2调控二烯丙基二硫诱导的G2/M期阻滞作用及相关周期蛋白表达［J］.生物化学与生物物理进展，2010，37(2):184－9.

［7］ Ling H，Lu L F，Wen L，et al.Interference of Chkl/2 by RNA regulates G2/M arrest and expressions of cell cycle related proteins induced by diallyl disulfide［J］.Prog Biochem Biophys，2010，37 (2):184－9.

［8］ Ling H，Wen L，Ji X X，et al.Growth inhibitory effect and Chk1-dependent signaling involved in G2/M arrest on human gastric cancer cells induced by diallyl disulfide［J］.Braz J Med Biol Res，2010，43(3):271－8.

［9］ 刘 瑶，向姝霖，袁静萍，等.二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞分化的差异蛋白质分析［J］.中国药理学通报，2012，28(5):671－6.

［9］ Liu Y，Xiang M L，Yuang J P，et al.Proteome analysis of human gastric cancer MGC803 cells induced by diallyl disulfide［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(5):671－6.

［10］马艳华，史 玲，苏 琦.LIM激酶与肿瘤［J］.国际病理科学与临床杂志，2009，29(6):490－3.

［10］Ma Y H，Shi L，Su Q.LIM kinase and tumor［J］.Int J Pathol Clin Med，2009，29(6):490－3.

［11］章 硕，姜 浩，苏 埼.Rac1与肿瘤的研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2011，31(5):410－4.

［11］Zhang S，Jiang H，Su Q.Advances in research on Rac1 and tumor［J］.Int J Pathol Clin Med，2011，31(5):410－4.

［12］Kobayashi M，Nishita M，Mishima T，et al.MAPKAPK-2-mediated LIM-kinase activation is critical for VEGF-induced actin remodeling and cell migration［J］.EMBO J，2006，25(4):713－26.

［13］Vlachos P，Joseph B.The Cdk inhibitor p57(Kip2)controls LIM-kinase 1 activity and regulates actin cytoskeleton dynamics［J］.Oncogene，2009，28(47):4175－88.

［14］吴勇军，唐 仪，李 筝，等.胃癌中LIMK1的表达及其病理意义［J］.临床与实验病理学杂志，2011，27(6):658－60.

［14］Wu Y J，Tang Y，Li Z，et al.The expression of LIMK1 and pathologic significance in gastric cancer［J］.J Clin Exp Pathol，2011，27(6):658－60.

［15］史 玲，苏 坚，廖前进，等.二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭［J］.中国药理学通报，2011，28(2):200－5.

［15］Shi L，Su J，Liao Q J，et al.Diallyl Disulfide inhibits migration and invasion in human Colon cancer SW480 cells by downregulating expression of LIMK1［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，28 (2):200－5.